液相色谱仪梯度优化的技巧

有许多种优化操作，主要取决于您的目的和分析方法的科学性。还是分析时间？从测试的成本中？还是准确？由于目的不同，许多方法需要改变。例如，为了缩短分析时间，需要更多地选择短柱，更少地使用梯度。如果分析时间长，液相色谱仪色谱柱需要更长，成本高。

我认为你问的最重要的事情是优化这种分析方法分析方法的优化应以流动相、液相色谱仪色谱柱、柱温、检测器、梯度洗脱和样品预处理为基础。我以前写过研究和分析方法的发展。你可以从网上下载。

反相色谱的流动相通常以水为基础,然后加入一定量的水溶极性调节剂,如甲醇,乙腈,四氢呋喃等,极性调节剂的性质和比例对溶质的保留和分离选择性有显著影响。一般来说，甲醇-水体系可以满足大多数样品的分离要求，流动相因其粘度低、价格低廉而成为反相色谱最常用的流动相。但是，我建议您使用乙腈-水体系进行初步实验，因为乙腈比甲醇具有更高的溶剂强度和更低的粘度，能够满足185 ~ 205纳米紫外检测的要求。因此，乙腈-水体系总体上优于甲醇-水体系。在分离极性差异大的多组分样品时，还需要梯度洗脱技术，以使各组分具有合适的K值并分离良好。在反相色谱中，如果同时分离同一组样品，甲醇/水作为冲洗剂的洗涤强度比与乙腈/水或四氢呋喃/水的洗涤强度比有关，具体如下：

C乙腈= 0.32c2 甲醇++0.57C甲醇

C四氢呋喃= =0.66C甲醇

C是不同有机溶剂与水混合的体积百分比含量  100％甲醇的洗涤强度相当于89％乙腈/水或66％四氢呋喃/水的洗涤强度。

乙腈的毒性是甲醇的5倍，乙醇的25倍  价格是甲醇的6~7倍。

由于硅胶表面的硅轻基团（SiOH）或其他极性基团的极性很强，分离顺序基于样品中各组分的极性，即先将极性较弱的组分冲出液相色谱仪的色谱柱。

正相色谱中使用的流动相的极性相对低于固定相，如己烷、氯氟烃、亚甲基氯醚等。

正相色谱的固定相通常是硅胶和其他带有极性功能胺基的键合相填料，如（NH2，APS）和氰基（CN，CPS）

由于硅胶表面的硅轻基团（SiOH）或其他极性基团的极性很强，分离顺序基于样品中各组分的极性，即先将极性较弱的组分冲出液相色谱仪的色谱柱。

2.流动相酸碱度的选择:大多数反相色谱柱的酸碱度稳定范围为2-7.5，不应该超过液相色谱仪色谱柱的酸碱度范围。C18色谱柱的一般ph范围为2-8。当流动相的ph值小于2时，键合相将发生水解。当弱酸（3≤pKa≤7）或弱碱（7≤pKa≤8）样品用液相色谱仪的反相色谱分离时，调整流动相ph值的技术称为反相对于弱酸，流动相的酸碱度越小，组分的钾值就越大。当酸碱度远小于弱酸的pKa值时，弱酸主要以分子形式存在。对于弱势群体，情况正好相反。当分析弱酸样品时，通常向流动相中加入少量弱酸，并且通常使用50摩尔/升磷酸盐缓冲液和1％乙酸溶液。分析弱碱样品时，

通常在流动相中加入少量弱碱，通常为50摩尔/升磷酸盐缓冲液和30摩尔/升三乙胺溶液。注：在流动相中加入有机胺,可以减弱碱性溶液与残余硅烷醇之间的强相互作用,减少或消除峰尾现象,因此,在这种情况下,有机胺(如三乙胺)也称为去尾剂或清除剂。

3.波长选择:首先在可见紫外分光光度计上测量样品液体的吸收光谱，选择合适的测量波长，如最灵敏的测量波长，避免其他物质的干扰  高效液相色谱仪中的响应值通常也可以从紫外光谱中得知。如果吸光度小于0.5，用高效液相色谱仪（高效液相色谱法）法测定的面积将非常小。