实验室WesternBlot荧光实验干货分享

听说隔壁实验室买了一台新成像，可以做Western Blot荧光扫描式Azure Sapphire成像，效果很好，操作也简单，小师妹一脸羡慕，问了句，我从来没做过荧光实验，现在期刊杂志要求也在升级，也建议使用荧光的方法，之前因为没有合适的仪器，所以不能尝试，现在可以准备我的实验了，那从化学到荧光Western Blot实验，有哪些注意事项，或者哪些不同呢？

Azure Sapphire双模式多光谱激光成像系统

实验室大师兄这时候走过来，听听师兄给你的建议，以后要多看书，知道吗？

一、增加浓度

与化学发光Western Blot相比，所需的一抗和二抗的浓度可能会增加，这也取决于您使用的成像仪系统。在激光成像器中，这种影响可能不太明显。

二、首先进行单色实验测试

首先单独测试您的抗体非常有意义。这样，您可以确定最佳浓度，在简单的环境中可以把背景或非特异性的因素考虑进去，而不是一次性分析3种不同的一抗和二抗。

三、使用吸附性二抗

虽然听起来很简单，但许多人并不考虑，他们将多种抗体、多个物种加入到单一的印迹中。如果您在其他研究领域使用多重荧光，您可能已经意识到二抗的交叉吸附，减少物种间交叉反应性的重要性。但在Western中，很多人并不考虑，这是值得检查的，以确保他们达到要求。

四、扩展光谱

三色Western Blot是令人兴奋，那五种颜色呢？可以大大增加对不同波峰的区分。显然，这可能需要一些工作进行抗体优化，一次用于5个蛋白的检测可以节省时间和成本花费。

五、检查印迹膜

尽管越来越多的荧光印迹膜正在开发中，但一些膜在UV光源暴露下发出自发荧光产生高背景信号。为了增加灵敏度，我们建议在做荧光Western Blot时使用低荧光的PVDF膜代替NC膜。

六、为蛋白选择合适的通道

对于标准荧光，高丰度蛋白使用蓝色通道进行检测，中等丰度和低丰度蛋白分别使用绿色和红色通道检测。此外，使用激光NIR，可获得极好的灵敏度和低背景，也是低丰度蛋白检测的理想选择。