实验室分析方法的验证原来如此重要

  任何分析测试的目的都是为了获得稳定、可靠和准确的数据，分析方法验证也在其中起着极为重要的作用。方法验证的结果可以用于判断分析结果的质量、可靠性和一致性。这是所有分析质量管理体系不可分割的一部分，许多法规和质量管理标准也要求是暗示进行分析方法的验证。

　　何时进行方法验证

　　在下列情况下，要求对分析方法进行验证、证实或重新验证：

　　1.首次用于常规检测前;

　　2.转到另一个实验室时;

　　3.采用《药典》及其它法定标准未收载的检验方法;

　　4.法规规定的其他需要验证的检验方法。

　　分析测量的目的是产生准确可靠的数据。只有方法验证是无法保证这一目标的实现，但是应当将其作为分析测量质量保证体系的一部分。

　　图1揭示了影响数据质量的不同因素

　　仪器确认意味着仪器有确定的技术指标、经过检测并证实其适用于需要验证的方法。接着，在经过确认的仪器上验证分析方法，证明其按预期要求运行。这个过程不依赖于任何特定的仪器。如果我们希望方法能在不同厂家的仪器上使用，也应使用那些仪器进行方法验证。

　　法规和质量管理标准要求

　　对分析实验室有影响的法规和质量管理标准都要求进行分析方法验证。有的法规中直接使用“验证”一词，并列出特定参数，也有的法规用这样的陈述暗示验证要求——“检测方法应适合于预期用途。”验证要求指南出自各类不同的机构，但验证目的都是为了获得有效的分析检测结果。这对于通过分析检测来确保产品质量和安全而言是非常重要的。

　　图2. ICH、USP和ISO 17025中的方法验证参数。

　　验证内容八项

　　准确度、精密度(包括重复性、中间精密度和重现性)、专属性、检测限、定量限、线性、范围和耐用性。

　　一、准确度： 是指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般以百分回收率表示。至少用9次测定结果进行评价。

　　二、精密度： 是指在规定的条件下，同一个均匀样品，经过多次取样测定所得结果之间的接近程度。用偏差、标准偏差或相对标准偏差表示。

　　1、重复性：相同条件下，一个分析人员测定所得结果的精密度称为重复性。至少9次。

　　2、中间精密度： 一个实验室，不同时间不同分析人员用不同设备测定结果的精密度。

　　3、重现性：不同实验室，不同分析人员测定结果的精密度。分析方法被法定标准采用应进行重现性试验。

　　三、专属性：指在其他成分可能存在的情况下，采用的方法能准确测定出被测物的特性，用于复杂样品分析时相互干扰的程度。鉴别反应、杂质检查、含量测定方法，圴应考察专属性。

　　四、检测限：指试样中被测物能被检测出的最低量，无须定量。用百分数、ppm或ppb表示。

　　五、定量限：指样品中被测物能被定量测定的最低量，测定结果应具一定的精密度和准确度。

　　六、线性：系指在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度。

　　七、范围：能达到一定的精密度、准确度和线性的条件下，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。

　　八、耐用性：指在一定的测定条件稍有变动时，测定结果不受影响的承受程度。

　　方法验证的具体内容

　　(一)准确度

　　准确度系指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般用回收率(%)表示。准确度应在规定的范围内测试。用于定量测定的分析方法均需做准确度验证。

　　1.测定方法的准确度

　　可用已知纯度的对照品做加样回收测定，即于已知被测成分含量的供试品中再精密加入一定量的已知纯度的被测成分对照品，依法测定。用实测值与供试品中含被测成分量之差，除以加入对照品量计算回收率。

　　在加样回收试验中，应注意对照品的加入量与供试品中被测成分含有量之和必须在标准曲线线性范围之内;应注意加入对照品的时间(供试品预处理前);对照品的加入量要适当，过小则引起较大的相对误差，过大则干扰成分相对减少，真实性差。

　　2.数据要求

　　在规定范围内，取同一浓度的供试品，用6个测定结果进行评价;或设计3个不同浓度，每个浓度分别制备3份供试品溶液进行测定，用9个测定结果进行评价，一般中间浓度加入量与所取供试品含量之比控制在1:1左右。应报告供试品取样量、供试品中含有量、对照品加入量、测定结果和回收率(%)计算值，以及回收率(%)的相对标准偏差(RSD%)或可信限。

　　(二) 精密度

　　精密度系指在规定的测试条件下，同一个均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。精密度一般用偏差、标准偏差或相对标准偏差表示。

　　用于定量测定的分析方法均应考察方法的精密度。精密度包括重复性、中间精密度和重现性。

　　1.重复性 在相同操作条件下，由一个分析人员在较短的间隔时间内测定所得结果的精密度称为重复性。

　　在规定范围内，取同一浓度的供试品，用6个测定结果进行评价;或设计3个不同浓度，每个浓度各分别制备3份供试品溶液进行测定，用9个测定结果进行评价。

　　2.中间精密度

　　在同一个实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备测定结果之间的精密度，称为中间精密度。 为考察随机变动因素对精密度的影响，应进行中间精密度试验。变动因素为不同日期、不同分析人员、不同设备等。

　　3.重现性

　　在不同实验室由不同分析人员测定结果之间的精密度，称为重现性。

　　当分析方法将被法定标准采用时，应进行重现性试验。例如，建立兽药典分析方法时应通过不同实验室的复核检验得出重现性结果，复核检验的目的、过程、重现性结果均应记载在起草说明中。应注意重现性试验用的样品本身的质量均匀性和贮存运输中的环境影响因素，以免影响重现性结果。

　　4.数据要求 均应报告标准偏差、相对标准偏差或可信限。

　　(三)专属性

　　1.意义与要求

　　专属性系指在其他成分可能存在下，采用的方法能正确测定出药材、饮片、药材提取物或制剂中被测成分的特性。鉴别、限量检查、含量测定等方法均应考察其专属性。如方法不够专属，应采用其他方法予以补充。

　　2.鉴别试验

　　鉴别应能与可能共存的物质或结构相似化合物区分。不含被测成分的供试品，以及结构相似或组分中的有关化合物，均不得干扰测定。显微鉴别、色谱及光谱鉴别等应附相应的代表性图像或图谱。

　　3.含量测定和限量检查

　　以不含被测成分的供试品(除去含待测成分药材或不含待测成分的模拟复方)试验说明方法的专属性。色谱法和其他分析方法，应附代表性图谱，并标明主成分在图中的位置，以空白对照(除去含待测成分药材或不含待测成分的模拟复方)试验说明方法的专属性。色谱法中的分离度应符合要求，必要时可采用二极管阵列检测和质谱检测，对色谱峰进行定性检查。

　　(四)检测限

　　检测限系指供试品中被测物能被检测出的最低量。确定检测限常用的方法如下。

　　1.直观法

　　用一系列已知浓度的供试品进行分析，试验出能被可靠地检测出的最低浓度或量。 可用于非仪器分析方法，也可用于仪器分析方法。

　　2.信噪比法

　　仅适用于能显示基线噪音的分析方法，即把已知低浓度供试品测出的信号与空白样品测出的信号进行比较，算出能被可靠地检测出的最低浓度或量。一般以信噪比为3∶1或2∶1时相应浓度或注入仪器的量确定检测限。

　　3.数据要求应附测试图谱，

　　说明测试过程和检测限结果。

　　(五)定量限

　　定量限系指供试品中被测成分能被定量测定的最低量，其测定结果应具一定准确度和精密度。用于限量检查的定量测定的分析方法均应确定定量限。

　　常用信噪比法确定定量限。一般以信噪比为10∶1时相应的浓度或注入仪器的量进行确定。

　　(六)线性

　　线性系指在设计的范围内，测试结果与供试品中被测物浓度直接呈正比关系的程度。

　　应在规定的范围内测定线性关系。可用一贮备液经精密稀释，或分别精密称样，制备一系列供试品的方法进行测定，至少制备5个浓度的供试品。以测得的响应信号作为被测物浓度的函数作图，观察是否呈线性，再用最小二乘法进行线性回归。必要时，响应信号可经数学转换，再进行线性回归计算。

　　数据要求：应列出回归方程、相关系数和线性图。

　　(七)范围

　　范围系指能达到一定精密度、准确度和线性，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。 范围应根据分析方法的具体应用和线性、准确度、精密度结果及要求确定。对于有毒的、具特殊功效或药理作用的成分，其范围应大于被限定含量的区间。溶出度或释放度中的溶出量测定，范围应为限度的±20%。

　　(八)耐用性

　　耐用性系指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为使方法用于常规检验提供依据。开始研究分析方法时，就应考虑其耐用性。如果测试条件要求苛刻，则应在方法中写明。典型的变动因素有：被测溶液的稳定性，样品提取次数、时间等。液相色谱法中典型的变动因素有：流动相的组成比例或pH值，不同厂牌或不同批号的同类型色谱柱，柱温，流速及检测波长等。气相色谱法变动因素有：不同厂牌或批号的色谱柱、固定相，不同类型的担体，柱温，进样口和检测器温度等。薄层色谱的变动因素有：不同厂牌的薄层板，点样方式及薄层展开时温度及相对湿度的变化等。经试验，应说明小的变动能否通过设计的系统适用性试验，以确保方法有效。

　　(九)系统适用性试验

　　对一些仪器分析方法，在进行方法验证时，有必要将分析设备、电子仪器与实验操作、测试样品等一起当作完整的系统进行评估。系统适用性便是对整个系统进行评估的指标。系统适用性试验参数的设置需根据被验证方法类型而定。

　　色谱方法对分析设备、电子仪器的依赖程度较高，因此所有色谱方法均应进行该指标验证，并将系统适用性作为分析方法的组成部分。具体验证参数和方法参考《中国兽药典》有关规定。

　　方法再验证

　　在某些情况下，如原药提取工艺改变、制剂处方或工艺改变、分析方法改变等，均有必要对分析方法再次进行全面或部分指标的验证，以保证分析方法可靠，这一过程称为方法再验证。再验证原则：根据改变的程度进行相应的再验证。

　　当原药提取工艺或制剂工艺发生改变时，含量测定方法的专属性就需要再进行验证，以证明含量测定方法中发生的成分变化对主成份的测定无干扰。

　　当制剂的处方组成改变、辅料变更时，可能会影响鉴别的专属性、溶出度和含量测定的准确度，因此需要进行辅料对鉴别、对含量测定影响的方法再验证。

　　当质量标准中某一项目分析方法发生改变时，如采用高效液相色谱法测定含量时，检测波长发生改变，则需要重新提供检测限、专属性、准确度、精密度、线性等相应的方法学研究资料，证明修订后分析方法的合理性、可行性。

　　验证报告和其他文件

　　一旦方法开发并经过验证，即应形成验证报告。报告应包含足够的信息以使经验丰富的分析人员能够重复验证研究。验证报告通常应包含以下内容： 方法的目的和范围(适用性、类型)、方法简述、职责、 化合物类型和基质、 所有化学品、试剂、参考标准、QC样品及其纯度、级别、来源或制备的详细要求、 标准物质和化学品的质量检查程序安全预防措施、 从方法开发实验室转到常规分析的方法实施计划和程序从耐用性试验得到的重要参数、 如何进行实验的详细参数和条件，包括样品制备和方法参数统计程序和代表性计算公式 常规分析中的QC过程，如系统适用性试验 代表性图表，如色谱图、光谱图和包含原始数据的校正曲线方法的接受限度和性能数据预期的测量不确定度结果重新验证的判断准则 方法开发和验证人员的资质记录。

　　小结

　　在规范化或质量管理标准环境下运行的实验室推荐采用正式方法，诸如ISO或药典规定方法。例如，美国食品药品和化妆品法案要求FDA监管行业使用法定方法或证明其等效性。ISO/IEC 17025要求：“应优先使用以国际、区域或国家标准发布的方法。”这些方法已经得到验证，因此，许多分析人员错误地认为这类方法不需要在实验室中做任何进一步的验证、证实或试验即可投入使用。要知道，所有检测方法的适用性应在实际应用条件下得到证实。ISO/IEC 17025在5.4.2中有类似的要求：“在引入检测或校准之前，实验室应证实能够正确地运用这些标准方法。如果标准方法发生了变化，应重新进行证实。