CRISPR实验利器：BTX电转仪

什么是 CRISPR?

CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）, 是细菌中用于与病毒进行斗争的免疫武器。 生命进化历史上，细菌为了将病毒的外来入侵基因清除，进化出 CRISPR 系统，利用这个系统，细菌可以不动声色地把病毒基因从自己的染色体上切除，这是细菌特有的免疫系统。这种切除功能其中比较典型的模式是依靠一个复合物，该复合物能在一段 RNA 指导下，定向寻找目标 DNA 序列（图 1），并招募一个蛋白（如 Cas9）（图 2）,Cas9 能够将该序列进行切除（图 3）。正是基于细菌的这种后天免疫防御机制，CRISPR/Cas9 技术应运而生，从而使科学家们利用 RNA 引导 Cas9 核酸酶实现对多种细胞基因组的特定位点（如 NHEJ 非同源性末端接合) (图 4) 进行修饰。

为什么要电转？

CRISPR 革命已经开始，将 CRISPR 结构导入特定细胞 (如干细胞、神经细胞、造血细胞、受精卵, 等等) 用普通地方法往往很困难。电穿孔技术可使这些细胞在精确的电脉冲作用下，在细胞膜上形成瞬时的空隙，从而诱导 CRISPR 结构通过这些空隙进入细胞中。在电脉冲撤离后，细胞恢复原有状态，这种物理学的方式并不影响细胞内部任何代谢及生理变化。

BTX 电转和 CRISPR

外源物质如何高效的进入目的细胞是进行表达修饰实验（CRISPR、基因编辑、基因工程）成功的关键。BTX 电穿孔系统由于它的易用性、重复性、高效率和低毒性，已经成为将 CRISPR 结构导入细胞（如哺乳动物细胞、细菌、酵母、植物、寄生虫等）的重要手段。

使用 BTX 系统可进行多种类型转染；

体外培养--贴壁细胞、悬浮细胞及原代细胞·在体·在卵内·在子宫内·离体

使用 BTX 系统可转染 CRISPR 到多种细胞，包括很多难转染的细胞。

神经细胞 • 原代细胞 • 免疫细胞 • 胚胎细胞 • 受精卵 • 寄生细胞

Why BTX?

（一）使用新的卵母细胞电极进行卵母细胞/胚胎电转

卵母细胞电极:
● 可用于高通量小鼠卵母细胞、受精卵或者胚胎的 CRISPR/Cas9 基因编辑
● 易于使用，快速，高通量
● 每次可以操作 20 – 40 个卵母细胞
● 电转过程可视
● 容易收集电转后所有的胚胎细胞

在动物模型中，使用 BTX 卵母细胞电极配件，可以高效率、 高通量进行店转实验。

使用不同的电极存活率不同

（二）使用 BTX 电转仪将 CRISPR/Cas9 质粒转染进难转染的细胞。例如：Taxoplasma gondii 

A) 在 Taxoplasma gondii 细胞中，CRISPR 质粒 (pU6-SAG1) 切断 SAG1 位点

B) 成功转染的细胞 (绿色) 与 模拟（mock）转染细胞比较

来源:
Efficient Genome Engineering of Toxoplasma gondii using CRISPR/Cas9 Sidik SM, et al., 2014
Plos One, volume 9, Issue 6, July 2014