在线样品制备的LC／MS／MS测三聚氰胺

Turbo Flow在线样品前处理和TSQ Quantum LC/MS/MS系统在乳制品中三聚氰胺的分析中具有方便快速和高灵敏度的特点，可以在5~10min内直接分析含量低至10ppb三聚氰胺的奶粉及乳制品样品，并获得超过3000的信噪比。

2007年，美国国家食品安全与技术中心借助Thermo Scientific TSQ Quantum UltraTM 三重四极杆液相色谱串联质谱仪，建立了一种新的液相色谱串联质谱方法测定食品中的三聚氰胺。今天，Thermo Fisher Scientific将独有的在线样品前处理技术Turbo Flow色谱净化和TSQ Quantum LC/MS/MS分析结合，使分析流程得到大大简化，并实现了操作自动化。Turbo Flow是一种可以除去复杂样品中蛋白质等大分子成份的在线样品净化方法，因而不需要传统的蛋白沉淀、液液萃取和SPE等步骤，有效缩短了样品预处理的时间，提高了分析速度，同时提高了数据的可靠性，检出限低至10ppb，而且降低了分析成本。在针对建立快速检测方法以应付全国食品安全的突发性事件时具有实用意义。另外，在方法中还用了QED MS/MS功能进行全谱扫描后再作谱库检索，该数据是在同一次进样中得到的，提供了额外的确证信息。

图1.  1ppb的三聚氰胺、三聚氰酸和其内标物--13C3标记的三聚氰胺和三聚氰酸的色谱图（由上至下依次为：三聚氰酸、13C3标记的三聚氰酸、三聚氰胺、13C3标记的三聚氰胺）。

药品和试剂

除了特别说明的试剂外，所有使用的有机溶剂均为色谱纯，并购自Thermo Fisher Scientific（Fair Lawn, NJ, USA）；三聚氰胺和30％（w/w）氨水购自Sigma （St. Louis, MO, USA）；所使用的内标是13C3标记的三聚氰胺，由13C3氯化三聚氰标记，也购自Sigma（St. Louis, MO, USA）；Milli-QTM超纯水系统提供了18MΩ的实验用水，Milli-QTM超纯水系统购自Millipore（Billerica, MA, US）。

标准溶液制备：先用50%（v/v）甲醇水分别配制1000μg/ml的三聚氰胺溶液。分别取1ml上述溶液，用1:3的水-乙腈进行稀释，获得终浓度为10μg/ml的储存标准溶液。另外，分别取10μg/ml的储存标准溶液1ml，用乙腈进行连续稀释，获得1~1000ng/ml范围内的8个标准工作溶液。取50μl内标储存标准溶液分别加入到1ml上述8个标准工作溶液中，即为校正标准溶液。

图2.  三聚氰胺的标准曲线（浓度范围为1~1000ng/ml，左图给出的是1~1000ng/ml完整范围内的标准曲线，右图则是左图中10~100ng/ml区段的放大）。

样品制备：取固体样品0.5g，加入内标准品，用1.5ml（1:1）乙腈/水抽提，离心，取上清液。

分析方法

Turbo Flow色谱条件

仪器：Thermo Cohesive Turbo Flow Systems；

色谱柱：CycloneMCX 0.5x50mm；

流动相：上样：0.1%甲酸水溶液，洗脱：甲醇/2%氨水（50:50）；

进样体积：20μl；

液相色谱条件

色谱柱：BioBasicTM AX（Thermo Fisher Scientific, Bellefonte, PA），粒径5μm、内径2.1mm、长150mm（或50mm），柱温：30℃。最初流动相为乙腈-异丙醇-50mM 醋酸铵，其各组份比率为85:10:5，流速为400μl/min。5min以后，流动相立即改变为9:1的水-乙腈，流速转换为500μl/min，平衡5min。流动相再变回到最初的流动相，流速也换回到400μl/min。在最初的1.5min里，柱子另一端的流出液接入废液，随后接在质谱上，即运行保留时间。

图3.  三聚氰酸的标准曲线（浓度范围为1~1000ng/ml，左图给出的是1~1000ng/ml完整范围内的标准曲线，右图则是左图中10~100ng/ml区段的放大）。

质谱条件

质谱：TSQ Quantum Ultra系列质谱仪（Thermo Scientific）；

源极：加热电喷雾离子源（H-ESI）；

离子化：正离子电喷雾离子源；

鞘气压（N2）：65 units；

辅助气压（N2）：35 units（250℃）；

离子传输管温度：350℃；

扫描时间：200ms；

Q1/Q3分辨率:0.7FWHM。

SRM离子对

13C3标记的三聚氰胺                  三聚氰胺（内标）

m/z127→68@ 32eV                   m/z130→70@ 32eV

m/z127→85@ 18eV                   m/z130→87@ 18eV

QED-MS/MS条件

碰撞能量：30eV；

反向碰撞能量（RER）：50eV。

结果图1是三聚氰胺、三聚氰酸、13C3标记的三聚氰胺和三聚氰酸的标准色谱图。图2、3分别为三聚氰胺、三聚氰酸浓度范围为1~1000ppb的标准曲线，该标准曲线在整个浓度范围内具有较好的线性关系。同时，在图中也给出了该曲线中1~100ppb区段的放大图。从图4可以看出，在奶粉样品谱图中有三聚氰胺、三聚氰酸相应的尖峰，其分别为10ppb、50ppb，而且其他杂峰也很少。可见，Turbo Flow在线样品前处理对除杂质有很好的效果。另外，通过使用QED-MS/MS扫描功能收集到全谱数据，QED-MS/MS是指当一个特殊的SRM反应达到阈值水平时，MS/MS全扫描功能就被激活。全谱扫描数据在谱库中进行搜寻，从而对目标成份进行确认，并消除假阳性。

图4.  奶粉中三聚氰酸、三聚氰胺分析检测色谱图，其含量分别为50ppb、10ppb。

三聚氰胺含量为10ppb的奶粉样品QED-MS/MS全扫描谱图在谱库中进行搜寻时，谱库给出最匹配化合物为三聚氰胺（见图5）。

图5.  10ppb三聚氰胺谱图对照谱库的搜寻结果，三聚氰胺跟其匹配率最高。

图5的左下四分之一处是样品的谱图和谱库给出的匹配标准谱图，上面为样品谱图，下面为谱库给出的匹配标准谱图。从图上可见两者有很好的匹配度。

结论

文章介绍了一种专门针对乳制品中三聚氰胺、三聚氰酸进行检测并定量的方法，经证实，该方法中的在线样品前处理，免除了传统使用的蛋白沉淀、液液萃取和SPE等步骤，因此操作简单、速度快、灵敏度高，检出限可低至10ppb。该方法可被用于高通量快速定量和确证分析。另外，QED-MS/MS得到的全谱扫描功能，允许在谱库中进行结果对比查找，从而避免了假阳性。