具有高分辨、高灵敏度和高通量等优势的超高效液相色谱技术（UPLC），特别适合监控流动反应及开发优化条件。本文以DMF体系升温条件下向3,4-二氟硝基苯中加入吗啉的流动反应为例，通过对反应体系流出液取样和监测，对连续流动反应中的起始原料、终产品和潜在杂质的存在情况和动力学参数进行表征，并在优化反应条件下建立对低含量杂质或中间产物的UPLC分析法。
采用连续流动化学系统来优化化学合成工艺，既可提高产量和产率，又易于扩展和控温，且制造过程更安全。确定流动反应的最佳条件至关重要。作为流动反应过程的一部分，最终产物反应动力学特征按温度、压力、线圈停留时间和反应物计量来描述。但信息均在反应后获得，使反应过程不连续，且非常费时，而离线分析会影响到结果，为了改善反应时间线和定量的可靠性，采用在线监测技术更为有利。
光谱法或紫外法一直被用于定量主要产物，但方法产生的低含量杂质或中间产物以及形成动力学方面的信息很少。通过采用定量分离技术，如在线LC可显示关于最终产物和低含量杂质，同时自动化流动反应。既能充分了解反应情况，也可改善流程，保证最大产率和最高纯度。
超高效液相色谱（UPLC）非常适合监测流动反应的优化过程。该技术具有高分离度、高灵敏度和高通量等优势。分析分离效率随色谱柱中颗粒直径减小而增加。其优化线性速度随颗粒尺寸变小而增加。因此，色谱分离的运行会更快速且不影响分离度，同时该技术可快速和准确地描述流动反应的动力学特征。采用UPLC作为反应优化的传感器，需通过收集来自塞流反应的洗脱液和通过生产线取样分析完成自动开发监测反应物种的分析方法。一旦UPLC方法的条件成立，系统就会直接配置为在线取样流式反应器，反应条件被改变，以量化最终产物和过程杂质的最终浓度的影响。再利用该数据来确定最佳的流动反应条件。UPLC分析方法同样可用于监测流动反应从台式到试验到制造规模的扩展情况。
测试方案
测试对象
在DMF体系中，升温条件下向3,4-二氟硝基苯中加入吗啉，进行流动式化学反应工艺过程，反应式见图1。
图1. 向3,4-二氟硝基苯中加入吗啉的化学反应方程式。
测试系统及流程
流动反应在Uniqsis FlowSyn系统上进行，并通过PATROL UPLC实验室分析器系统对反应流出液取样和监测。为便于分析方法的开发，将FlowSyn配置为塞流分析，即将反应物注射入反应线圈，再通过流份收集器（可选配置）收集流份。样品由实验室分析器系统进行在线分析，开发可用于定量反应原料、终产物以及可能杂质的UPLC方法。一旦分析方法经过优化，实验室分析器系统可直接配置为FlowSyn系统的出口，等份样品被自动采样并以在线模式进样到UPLC系统分析。
图2. 筛选塞流实验样品的分析结果，产生最佳峰形和分离度的分离条件将被进一步优化。
分析方法
分析方法开发的色谱条件
系统： PATROL UPLC实验室分析器系统；数据分析： Empower 2软件；
色谱柱： ACQUITY UPLC BEH C18 2.1×50mm 1.7μm，ACQUITY UPLC BEH Phenyl 2.1×50mm 1.7μm，ACQUITY UPLC HSS T3 2.1×5mm 1.8μm，ACQUITY UPLC HSS C18 2.1×50mm?1.8μm；样品：DMF中的反应等份物；进样量：2μl；温度：40℃；流速：600 μl/min；洗脱液A1：10mM 甲酸铵pH 3；洗脱液A2：10mM碳酸氢铵 pH 10；洗脱液B1：乙腈；洗脱液B2：甲醇；梯度：5% ~ 95%B，洗脱2min以上；检测：245nm，20Hz正常；样品冲洗：30s；稀释：100倍；针洗：5s，60：20：20 乙腈/二甲基甲酰胺/水溶液。
表1. 流动反应优化变量及其对终产物和过程杂质相对数量的影响
最终色谱法
系统：PATROL UPLC实验室分析器系统；数据分析： Empower 2软件；色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3，2.1×5mm 1.8μm；样品：DMF中的反应等份物；进样量2μl；温度：60℃；流速：1ml/min；洗脱液A：10mM 甲酸铵pH 3；洗脱液B：甲醇；梯度：35%~75%，洗脱30s以上，保持15s；检测：245nm，40Hz正常；样品冲洗30s；稀释：100倍；针洗：5s，60：20：20乙腈/二甲基甲酰胺/水溶液。
图3. 流动反应媒介的最终梯度分离。
结果与讨论
UPLC分析方法的开发与优化
开发分析方法，需确保反应流出液含有未反应的初始原料、最终产物以及任何可能存在的反应副产物。按事先设计的分析筛选方案筛选pH条件和有机溶剂种类，通过选配的色谱柱管理器还可筛选不同的色谱柱，以达最佳分离条件。经初次筛选，最佳分离结果由低pH值缓冲液、甲醇以及HSS T3色谱柱的组合获得，如图2所示；通过二次筛选方案进一步优化，分析时间仅为45s，整个进样间隔时间（包括采样、稀释及软件处理时间）为2.6min，如图3所示。
图4. 考察每组反应条件时，至少在稳态下取三个样品可确保每个反应组分的定量可重现。
流动反应的参数评估与优化
Uniqsis FlowSyn系统 专门用于自动化的流动反应工艺开发，可设置实验矩阵进行，以评估线圈温度、化学反应计量、线圈内停留时间对最终产物的产率和纯度的影响。将该系统与实验室分析器系统连接，可自动检查每项反应条件。对每组条件，应在其反应稳定状态下收集足够数量的样品，以确保实现定量可重现（如图4所示）。由于通过开口管的液体层流在实验开始和结束时都会使反应物分散，因此达到反应稳态的时间取决于反应线圈的几何参数（长度和内径）。将该时间与在稳态下实现充分重复进样所需的时间相加，以确定在自动化实验中反应条件的改变时间。UPLC方法的最终运行时间为45s，采样和稀释额外需要的时间使进样循环时间增加到2.6min。在自动化实验中，每组反应条件都保持25min，以确保稳态下足够的进样次数。
生成一个反应变量矩阵，以检查线圈停留时间、反应温度和和反应物计量的影响。方法开发矩阵列示在表1中。变量可以编程至Uniqsis FlowSyn系统中，对序列进行初始化，在线样品自动采集支持无人值守运行。
图5. 每个流动反应变量及其对终产物（蓝）和过程杂质（红）形成的影响趋势图。
序列完成时，两个系统均被程控为自动冲洗并停机。对最终色谱数据进行分析，以确定每个反应变量对终产物和过程杂质产率的影响，最终相对数量列于表1，变量的变化趋势如图5所示。该数据可以用于计量学分析，以确定最佳反应条件。最终的反应条件确定为1.5倍过量的吗啉、11min线圈停留时间和100℃的线圈温度。这将使最终产物的产率最大，形成的过程杂质最少。
最终流动反应条件可放大至中试、车间或工厂生产规模，且PATROL UPLC过程分析器系统可用在制造车间进行监测。
小结
通过分析反应流出液的等份物，PATROL UPLC实验室分析器系统可监测流动反应的条件开发和优化。检测结果可反映所有变量的动力学特征，包括低含量水平的过程杂质。系统可轻松与自动台式流反应器Uniqsis FlowSyn系统连接，所开发的监测流动反应的方法可转换至PATROL UPLC工艺分析器系统，监测生产车间中的流动反应。
