快速检测乳品中的双氰胺

本文应用安捷伦QuEChERS前处理方法结合LC-MS/MS对乳品中的双氰胺实现了快速分析检测，不同的添加浓度，在0.5ppb~50ppb的线性范围内在乳粉中的添加回收率范围均在86%~97%之间，RSD均小于5%，方法具有很好的准确度和重复性。

双氰胺又名二氰二氨、氰基胍，其应用领域涉及化肥工业，用作氮肥增效剂和长效复合肥料添加剂；医药生产用于合成磺胺嘧啶和巴比妥类药物；还可用于多种染料的合成及加工黏合剂和塑料工业中的固化剂。

2013年1月，享誉全球的新西兰牛奶及奶制品被检测出含有低含量的有毒物质双氰胺，新西兰政府已经下令禁售含有双氰胺的奶类产品。新西兰奶粉双氰胺的来源是由于新西兰农民普遍会在牧场使用双氰胺来防止硝酸盐等对人体有害的肥料副产品流入河流或湖泊。

美国食品和药物管理局将双氰胺添加到安全性待检测物质名单,虽然国际标准未对食品中的双氰胺限量，但高剂量的双氰胺对人体是有毒的，所以建立乳制品中双氰胺分析检测方法势在必行。本方法即是为应对此突发食品安全案件，所建立的乳制品中双氰胺快速分析解决方案。

实验内容

仪器与试剂

安捷伦科技有限公司6460 QQQ质谱仪；安捷伦科技有限公司1290 Infinity UHPLC。

乙腈，异丙醇均为色谱纯 试验用水为高纯去离子水；双氰胺标准品（纯度）国家标准物质中心；奶粉为市售。

液相色谱柱为Agilent Zorbax-Rx-Sil (3.0×100mm, 1.8 家标，PN. 828975-301)，Bond Elut QuEChERs基质分散固相萃取15 ml净化管（P/N. 5982-5158 )，美国安捷伦公司。

标准品配制

准确称取0.010g双氰胺标准品 用甲醇/水（30/70）定容到10ml的容量瓶中，制成质量浓度为1000μg/ml的储备液， 从双氰胺储备液中取0.1ml用乙腈定容至10ml，制成质量浓度为10μg/ml的双氰胺标准溶液。

样品前处理

准确称取(2 ± 0.02) g奶粉样品于50ml具塞离心管中, 加入已知浓度的标准品混合均匀，再加入提取液（水：乙腈，V/V=1:4) 20ml，加盖后震荡均匀后，涡旋1min，超声10min，4℃ 10000r/min离心10min，取8ml上清液加入Bond Elut QuEChERs基质分散固相萃取15ml净化管（P/N.5982-5158）中，涡旋1min，取上清液加入1.5ml离心管中，13000rpm高速离心5min，将上清液转入2ml样品瓶中进行LC/MSMS检测。

仪器方法

高效液相色谱条件：色谱柱：Agilent Zorbax-Rx-Sil (3.0×100mm, 1.8μm，PN. 828975-301)；流动相：流动相A为10 mM的乙酸铵水溶液，流动相B为乙腈。洗脱梯度：0.0~2.0min，98%B；2.0~4.0min，98%B~70%B；4.0~5.0min，70%B~60%B；5.0~5.5min，60%B~40%B； 5.5~9.0min，40%B。流速：0.4ml/min；进样量：2.0μl；柱温：35℃；运行时间：9min。

质谱条件：仪器模式：+ESI（JetStream ESI）；干燥气温度（Gas Temp）325℃，干燥气流量（Gas Flow）8ml/min，雾化器压力（Nebulizer）40psi，鞘流气温度（Sheath Gas Temp）350℃，鞘流气流量（Sheath Gas Flow）11ml/min，毛细管电压（Capillary）4000V，喷嘴电压（Nozzle）0V；双氰胺的定量离子为85→68，定性离子为85→43。MRM参数见表1，安捷伦MassHunter软件用于定性和定量。

结果与讨论

样品前处理方法的考察

双氰胺属于水溶性较强的化合物，所以在提取液中加入一定量水进行提取，同时加入一定比例乙腈，除了可以对乳品中的蛋白起到很好的沉淀作用外，也与后续检测中高有机相比例进行匹配，更好地消除溶剂效应。试验中也同时考察了用Agilent Bond Elut PCX 柱进行萃取，发现PCX 柱对双氰胺基本没有保留，考虑到乳品中含有脂肪、磷脂、和蛋白类的非极性有机干扰物以及有机酸干扰物等，因此选择含有Agilent C18和 PSA 填料的Bond Elut QuEChERs 基质分散固相萃取净化试剂盒，以有效吸附乳品提取液中的基质干扰物，降低离子抑制效应。

仪器方法

本文对双氰胺采用电喷雾离子源正离子模式测试，实验结果表明双氰胺可以生成[M+H]+（m/z 85.1）分子离子峰，选择[M+H]+ 峰进行子离子扫描，最终确认双氰胺选择m/z 68（定量子离子）和43（定性子离子），作为多反应通道监测离子对。

由于双氰胺极性较强，在反相C18色谱柱上保留较弱，因此采用HILIC 机理对其进行分析，以Agilent Zorbax-Rx-Sil 作为HILIC 色谱柱，以高的有机相为梯度起始比例，进行分析。流动相中添加低浓度乙酸铵促进正离子电离，经过优化后的色谱图如图1所示。

仪器方法学考察了灵敏度，线性范围，稳定性及添加回收率等指标。其中灵敏度测试了0.5ppb 浓度标准品，其信噪比为55.2 ；大于10倍信噪比定量检出限，结果如图2所示。

在0.5 ppb~50ppb浓度范围内，测试线性相关系数大于0.999。各浓度点平行6针测试，峰面积的RSD 均小于6%，具有良好的稳定性，如表2所示。

方法的重复性

分别向空白乳粉中，加入5、10、50μg/kg 添加量的双氰胺标样，按照本方法的处理过程制备样品进行处理和测定，每个添加浓度取3 份样品，测试回收率。双氰胺的绝对添加回收率在86~97%之间，RSD 在2.49%~4.48%之间，如表3所示；标准品、空白样品和添加样品的谱图如图4 所示，可以看出双氰胺经Agilent Bond Elut QuEChERS 基质分散净化试剂盒净化后，基质效应很小，能达到很好的净化效果和较高的回收率。

小结

应用Agilent BondElut QuEChERS 基质分散净化试剂盒和1290UHPLC+6460 QQQ高灵敏度液质联用技术，可以实现对乳品中双氰胺残留量的检测确证分析，同时为乳品中双氰胺的快速筛查确证分析提供有力的解决方案。采用QuEChERs方法能够对双氰胺实现快速、高效的净化处理，净化后的样品基质效应较小，添加回收率可达到86%以上（无同位素内标校正）；采用6460 QQQ分析结果表明在0.5ppb浓度下双氰胺的信噪比(S/N)=55；在0.5ppb~50ppb浓度范围内,线性关系和稳定性优异，相关系数R＞0.999，峰面积RSD＜6%。