生化实验讲义(理论部分)——层析技术（六）

5. 洗脱速度

洗脱速度也会影响凝胶层析的分离效果，一般洗脱速度要恒定而且合适。保持洗脱速度恒定通常有两种方法，一种是使用恒流泵，另一种是恒压重力洗脱。洗脱速度取决于很多因素，包括柱长、凝胶种类、颗粒大小等，一般来讲，洗脱速度慢一些样品可以与凝胶基质充分平衡，分离效果好。但洗脱速度过慢会造成样品扩散加剧、区带变宽，反而会降低分辨率，而且实验时间会大大延长；所以实验中应根据实际情况来选择合适的洗脱速度，可以通过进行预备实验来选择洗脱速度。一般凝胶的流速是2－10 cm / hr，市售的凝胶一般会提供一个建议流速，可供参考。

总之，凝胶层析的各种条件，包括凝胶类型、层析柱大小、洗脱液、上样量、洗脱速度等等，都要根据具体的实验要求来选择。例如样品中各个组分差异较小，则实验要求凝胶层析要有较高的分辨率，提高分辨率的选择应主要包括：选择包括各个待分离组分但分离范围尽量小一些的凝胶，选择颗粒小的凝胶，选择分辨率高的凝胶类型，选择较长、直径较大的层析柱、减少加样量、降低洗脱速度等等。但正如前面讲过的，各种选择都有一个限度的问题，超过这个限度可能会产生相反的效果。另外需要提的一点是，实验时应尽可能的参考相关实验和文献以及进行预实验，以选择最合适的实验条件。

3.2.7 凝胶层析的应用

前面介绍了凝胶层析的基本理论以及基本实验操作，下面简单介绍一下凝胶层析在生物学方面的应用。

1. 生物大分子的纯化

凝胶层析是依据分子量的不同来进行分离的，由于它的这一分离特性，以及它具有简单、方便、不改变样品生物学活性等优点，使得凝胶层析成为分离纯化生物大分子的一种重要手段，尤其是对于一些大小不同，但理化性质相似的分子，用其它方法较难分开，而凝胶层析无疑是一种合适的方法。例如对于不同聚合程度的多聚体的分离等。

2. 分子量测定

前面已经介绍了，在一定的范围内，各个组分的Kav以及Ve与其分子量的对数成线性关系。

      Kav＝－b lg MW＋c

      Ve＝－b’ lg MW＋c’

由此通过对已知分子量的标准物质进行洗脱，作出Ve或Kav对分子量对数的标准曲线，然后在相同的条件下测定未知物的Ve或Kav，通过标准曲线即可求出其分子量。凝胶层析测定分子量操作比较简单，所需样品量也较少，是一种初步测定蛋白分子量的有效方法。这种方法的缺点是测量结果的准确性受很多因素影响。由于这种方法假定标准物和样品与凝胶都没有吸附作用，所以如果标准物或样品与凝胶有一定的吸附作用，那么测量的误差就会比较大；上面公式成立的条件是蛋白基本是球形的，对于一些纤维蛋白等细长的形状的蛋白不成立，所以凝胶层析不能用于测定这类分子的分子量；另外由于糖的水合作用较强，所以用凝胶层析测定糖蛋白时，测定的分子量偏大，而测定铁蛋白时则发现测定值偏小；还要注意的是标准蛋白和所测定的蛋白都要在凝胶层析的线性范围之内。

3. 脱盐及去除小分子杂质

利用凝胶层析进行脱盐及去除小分子杂质是一种简便、有效、快速的方法，它比一般用透析的方法脱盐要快得多，而且一般不会造成样品较大的稀释，生物分子不易变性。一般常用的是Sephadex G-25，另外还有Bio-Gel P-6 DG或Ultragel AcA 202等排阻极限较小的凝胶类型。目前已有多种脱盐柱成品出售，使用方便，但价格较贵。

4. 去热源物质

热源物质是指微生物产生的某些多糖蛋白复合物等使人体发热的物质。它们是一类分子量很大的物质，所以可以利用凝胶层析的排阻效应将这些大分子热源物质与其它相对分子量较小的物质分开。例如对于去除水、氨基酸、一些注射液中的热源物质，凝胶层析是一种简单而有效的方法。

5. 溶液的浓缩

利用凝胶颗粒的吸水性可以对大分子样品溶液进行浓缩。例如将干燥的Sephadex（粗颗粒）加入溶液中，Sephadex可以吸收大量的水，溶液中的小分子物质也会渗透进入凝胶孔穴内部，而大分子物质则被排阻在外。通过离心或过滤去除凝胶颗粒，即可得到浓缩的样品溶液。这种浓缩方法基本不改变溶液的离子强度和pH值。