GeneCopoeia基因克隆技术相关研究

与PCR、qPCR等技术一样，作为分子实验室必备手段，分子克隆技术被广泛用于多样的基因功能研究。所谓分子克隆指的是在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其他载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入宿主细胞内并获得持续稳定增殖能力和表达。

基因克隆技术的发展经历3个阶段，第一阶段为经典的T4 DNA连接酶介导的TA克隆及粘性末端克隆，第二阶段为基于DNA修饰酶的LIC系列克隆，第三阶段为基于DNA重组酶的Gateway克隆及一步法克隆。

基于T4 DNA连接酶的克隆

本系列克隆使用的酶类为：T4 DNA连接酶。

限制性内切酶：可以对目的片段和载体识别并切割出相同的粘性末端，用于碱基互补配对。

T4 DNA连接酶：可以催化目的片段和载体最后一位碱基上的5’磷酸基团和3’羟基形成磷酸二酯键，以实现将目的片段和载体连接成环状质粒。

根据是否使用限制性内切酶，可分为平末端克隆/TA克隆和粘性末端克隆。

基于DNA修饰酶的克隆方法

本系列克隆使用的酶类为：T4 DNA聚合酶

T4 DNA聚合酶具有3'→5'核酸外切酶活性和5'→3' DNA聚合酶活性。缺乏dNTP时，表现为3'→5'核酸外切酶活性，切割目的基因和载体，产生单链的DNA粘性末端；加入某一单独dNTP，3'→5'核酸外切酶活性和5'→3' DNA聚合酶活性平衡，掺入与切割动态平衡，切割终止。因此，T4 DNA聚合酶为基础的克隆方法的关键是目的基因和载体间需要有一定数量的重叠序列。

基于重组酶的克隆方法

Gateway克隆法——本系列克隆使用的酶类为：λ整合酶Int、λ切除酶Xis、大肠杆菌IHF因子。

该技术需要四个特异性重组位点（attB、aatP、attL、attR），引导发生两个特异性重组反应（BP反应和LR反应）。BP反应：将目的基因克隆进入入门质粒。使用到的酶为Int和IHF。LR反应：将入门质粒中的目的基因转移到终载体中，获得表达载体。使用到的酶为Int、IHF及Xis。表达载体若带有attR位点，则带有attL位点的入门克隆便可以与之发生LR反应，进而将入门克隆的目的基因转移到不同类型的表达载体中。

通过以上方法克隆的基因只有通过表达才能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理，克隆基因表达出所编码的蛋白质可供作结构与功能的研究。有些具有特定生物活性的蛋白质在医学上、以至在工业上都是很有应用价值的，可以克隆其基因使之在宿主细胞中大量表达而获得。而要使克隆基因在宿主细胞中表达，就要将它放入带有基因表达所需要的各种元件的载体中，形成表达克隆。此过程繁杂且周期长，GeneCopoeia可提供丰富多元的OmicsLinkTM即用型ORF表达克隆。这种即用型即用型表达克隆是将研究基因的ORF装在带有不同蛋白标签的表达载体中，可直接用于体内或体外不同宿主或表达系统的蛋白表达和功能研究，节约了实验人员耗费在亚克隆步骤上的大量精力和时间。