多色流式实验荧光素的选择（二）

3. 多色流式细胞检测中荧光素选择的原则

1) 根据机器配置选择荧光素

了解你使用的流式细胞仪的性能，大多数流式细胞仪有两个或者多个激光器，有五种波长可供选择：紫外（355 nm）、紫色（405 nm）、蓝色（488 nm）、黄色（561 nm）和红色（640 nm）。除了激光器，具体的激光片和检测器也决定了你的配置可同时检测多少种颜色。

多色标记荧光素搭配原则：每个通道只能选择一种荧光素；各个通道之间的荧光素可以随意搭配。常用的四色搭配为：FITC, PE, PerCP, APC。

2)尽量选择荧光度强的荧光素

FITC、PE、PC-CY5和APC是目前流式细胞检测常用荧光素，基本能满足日常临床和科研的需要，尽量选择荧光强的荧光素。细胞表面或者内部的各种抗原表达量也不同，如CD4和CD8在细胞表面的表达分子数很多，而CD25等分子在细胞上的表达量则不多，在用流式细胞术分析这些分子时应根据表达量选择荧光素，对于表达量较多的分子，可用FITC等弱荧光素，而对于表达量较少的分子，则须针对您特异的仪器配置，选用荧光较强的荧光素，如PE, PE-CY5或PE-CY5.5等。

3)保证搭配荧光素的质检发射光谱重叠度尽量小

当两种荧光基团的发射光谱重叠时，可能会观察到一种荧光基团渗漏到另一种的检测通道（如FITC和PE）。如果不适用荧光补偿技术，就很难分辨不同的群体。最好选择很少的或者没有重叠的荧光基团，以最大限度减少这种渗漏。选择试剂组合时将光谱叠加可能性降到最低，这可能与选择最亮的荧光素的规则是冲突的，如在进行四色分析，经常会将PE-Cy5标记的抗体与APC标记的抗体搭配使用，此搭配需较大幅度地调节两者的颜色补偿。可选用PE-Cy5.5来替代PE-Cy5，颜色补偿只需1%左右。因为Cy5的激发波长与APC的激发波长相近，所以PE-Cy5荧光素中的Cy5，也会被激发APC的第二个激光器（氦氖激光器）所激发，导致PE-Cy5与APC的颜色补偿很难调。相反，PE-Cy5.5中的Cy5.5激发波长为675nm，不能被激发APC的第二个激光器所激发，也就不存在Cy5.5对APC的干扰，颜色补偿也就很小。因此，可能需要牺牲个别荧光素的亮度来避免荧光渗漏以及敏感度丧失。

要通过单标对照进行补偿调节：

所以尽量选择光谱重叠度小的荧光素，如FITC/PE-Cy7； 选择不同激光激发的荧光素，如FITC/APC, PE/APC。

4) 尽量避免偶联荧光染料使用带来的假阳性

随着颜色的数量不断增加，实验中可能会用到偶联荧光染料。偶联荧光染料是指两种荧光素联接在一起进行荧光共振能量转移，如PE-Alexa-Fluor 647或APC-Cy7。但偶联荧光染料很容易降解，导致解偶联以及两个波长下的荧光发射，从而出现假阳性，若使用偶联的荧光素，务必要在短时间内尽快完成实验，曝光时间越长，荧光素就越不稳定。在固定和透化的过程中，偶联荧光染料的亮度可能降低，因此操作步骤应当尽可能温和。补偿值可通过以相同方式处理的样品来获得。