实用哺乳动物细胞培养手册（六）

缓冲系统

大多数细胞所需 pH 在 7.2 - 7.4。但是，细胞培养最适 pH 值随培养的细胞种类不同而 不同。成纤维细胞喜欢较高 pH (7.4 - 7.7), 而传代转化细胞系则需要偏酸 pH (7.0 - 7.4)。 由于多数培养液靠碳酸氢钠（NaHCO3）与 CO2 体系进行缓冲，因此，气相中的 CO2 浓度 应与培养液中碳酸氢钠浓度相平衡。如果气相或培养箱空气中 CO2 浓度设定在 5％，培养液中 NaHCO3 的加入量为 1.97g/L；如果 CO2 浓度维持在 10％，培养液中 NaHCO3 的加入量为 3.95g/L。细胞培养瓶盖不应拧得太紧，以保证气体交换。

HEPES 是一种非离子缓冲液，在 pH 7.2 - 7.4 范围内具有较好的缓冲能力，但是非 常昂贵，在高浓度时对一些细胞可能有毒。HEPES 缓冲液可与低水平的碳酸钠（0.34g/L） 共用，以抵消因额外加入 HEPES 引起的渗透压增加。在这种培养条件下，细胞培养瓶的 盖子应拧紧，以防止培养液中所需的少量碳酸盐散入空气中。大多数培养液中含有酚红作 为 pH 指示剂，酸性培养液呈橙黄色，碱性培养液呈深红色。

维生素

在细胞培养中，尽管血清是维生素重要来源， 但是许多培养基中添加了各种维生素以 适合更多的细胞系生长。

其它成分

在一些较为复杂的培养液中还包括其它一些成分。如在杂交瘤技术中常用的 DMEM 培 养液，使用时还需要补加丙酮酸钠和 2-巯基乙醇（2-Mercaptoethanol，2-Me）。2-Me 对细 胞生长有很重要的作用。有人认为它相当于胎牛血清，有直接刺激细胞增殖作用。2-Me 的活性部分是硫氢基，其中一个重要作用是使血清中含硫的化合物还原成谷胱甘肽，能诱 导细胞的增殖，为非特异性的激活作用。同时避免过氧化物对培养细胞的损害。另一个重 要作用是促进分裂原的反应和 DNA 合成，增加植物凝集素(PHA)对淋巴细胞的转化作用， 已广泛应用于杂交瘤技术，另外，也开始用于一些难以培养的细胞。2-Me 是一种小分子 还原剂，极易氧化。分子量为 78.13，纯的 2-Me 是一种无色有刺激味的液体，比重为1.110-1.120(Do20)，常用终浓度为 5×10-5M。常配制成 0.1M 的储存液，用时每升培养液 加 0.5ml。

液体培养基保存：

液体培养基应于 4℃冰箱避光保存，实验前放入 37℃预热。未加血清液体培养基有 效期为 12 个月。液体培养基中的 L-谷氨酰胺会随着储存时间的延长而慢慢分解。如果 细胞生长不良，可以再添加适量 L-谷氨酰胺。

干粉培养基保存：4℃冰箱避光保存，有效期 36 个月。

血清

细胞培养液中添加的血清有牛血清、马血清、人血清等，其中牛血清是最常用的血清， 分为胎牛血清和新生小牛血清。胎牛血清是从母牛破腹取出的胎牛中分离出的血清，价格 昂贵。新生小牛血清是从刚出生的尚未哺乳的小牛中分离出来的血清，如厂家能做到这一 点，新生小牛血清的质量与胎牛血清的质量相差不大。如小牛出生后已哺乳，从这种小牛 中取出的血清中可能含有较多的生物活性物质，其质量明显不如前两种。

血清的质量，种类及使用的浓度都有可能影响细胞的生长，而不同批次的血清支持细 胞生长的能力也不同，尤其是对克隆细胞的生长，某些批次血清可能含有毒性或抑制细胞 生长的物质。因此，在购买大量血清之前，必须对血清支持细胞生长能力进行检测，然后再，然后大量购买质量好的同一批号的血清，并注意以下几点：

（1）需要长期保存的血清必须储存于-20℃ – 70℃ 低温冰箱中。4℃冰箱中保存时间切 勿超过 1 个月。由于血清结冰时体积会增加约 10％，因此，血清在冻入低温冰箱前， 必须预留一定体积空间，否则易发生污染或玻璃瓶冻裂。

（2）一般厂商提供的血清为无菌，无需再过滤除菌。如发现血清有悬浮物，则可将血清 加入培养液内一起过滤，切勿直接过滤血清。

（3）瓶装血清解冻需采用逐步解冻法：-20℃ 至 -70℃ 低温冰箱中的血清放入 4℃冰箱 中溶解 1 天。然后移入室温，待全部溶解后再分装。在溶解过程中需不断轻轻摇晃均 匀（小心勿造成气泡），使温度与成分均一，减少沉淀的发生。切勿直接将血清从-20℃进入 37℃解冻，这样因温度改变太大，容易造成蛋白质凝集而出现沉淀。

（4）热灭活是指 56℃, 30 分钟加热已完全解冻的血清。加热过程中須規則搖晃均勻。此 热处理的目的是使血清中的补体成分（complement）灭活。除非必须，一般不建议作 此热处理，因为热处理会造成血清沉淀物显著增多，而且还会影响血清的质量。补体 参与反应有：细胞毒作用, 平滑肌细胞收缩, 肥大细胞和血小板释放组胺, 增强吞噬 作用, 促进淋巴细胞和巨噬细胞发生化学趋化和活化。

（5）切勿将血清在 37℃放置太久，否则血清会变得浑浊，同时血清中的有效成分会破会 而影响血清质量。

（6）血清中的沉淀物 絮状物：主要是血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成，这些絮状物不会影响血清本身的质量。可用离心 3000rpm, 5 分钟去除，也可不用处理。

显微镜下“小黑点”：经过热处理过的血清，沉淀物的形成会显著增多。有些沉淀物 在显微镜下观察象“小黑点”，常误认为血清受污染。一般情况下，此小黑点不会影 响细胞生长，但如果怀疑血清质量，则应立即停止使用，更换另一批号的血清。