优化色谱质谱参数获得理想的单抗轻重链分子质量（一）

1. 前言

现在，越来越多的生物制药公司开始使用 Orbitrap 类型的质谱进行单抗药物的表征分析，包括完整分子质量、轻重链分子质量、肽图、糖链、二硫键、宿主蛋白残留等等。基于分子质量测定的方法更加快速和直接，尤其是通过单抗轻重链分子质量测定的方法，不仅可以得到分子质量的信息，而且可以获得和轻重链相关的二硫键信息、部分氨基酸后修饰位点的信息，糖基化结合位置的信息、ADC 结合位置的信息等等，同时，相对于完整分子质量的分析，单抗轻重链分子质量测定可以帮助客户获得更加细化和准确的信息。在实际样品分析的过程中，我们可以通过优化色谱分离条件、质谱分析条件来获得最佳的轻重链分子质量谱图和相关信息。

目前，基于 Orbitrap 类型的 Q-Exactive 系列、LTQ-Orbitrap 系列、Orbitrap-Fusion 系列的质谱仪器都可以进行各种类型的单抗表征分析，在这里我们以 Q-Exactive plus 仪器为测试平台，进行了单抗轻重链分子质量分析的色谱和质谱参数优化，相似的参数可以直接应用到其它基于 Orbitrap 类型的质谱仪器上，为生物制药客户的实际样品分析提供了参考依据。

2. 实验部分

2.1 仪器和试剂

质谱仪器：Q-Exactive plus（赛默飞世尔科技，美国）；

色谱仪器：Dionex 3000 液相色谱系统（赛默飞世尔科技，美国）；

色谱柱：Agilent Zorbax 300，SB-C8, 3 μm，2.1×50 mm；

试剂：二次去离子水，色谱级乙腈，色谱级甲酸，DTT（Sigma-Aldrich）。

2.2 样品前处理方法

1 mg/mL 的 Herceptin 及其脱糖形式的单抗溶液，在保证 DTT 终浓度 20 mM 的条件下，37℃ 反应 2 小时，然后直接用于后续色谱质谱分析。

2.3 色谱质谱分析方法

色谱分析条件：具体见表 1；

表 1. 轻重链分子质量测定的色谱分析条件

（备注：该应用报告中，使用了 2 种不同的色谱梯度，10 分钟和 15 分钟，括号中为 15 分钟色谱梯度的设置参数。）

质谱分析条件：具体见表 2；

表 2. 轻重链分子质量测定的质谱分析条件

2.4 数据分析方法

采用 Protein Deconvolution 4.0 软件对原始质谱图进行去卷积处理，几个重要的参数需要进行调节，1）Target Mass：轻链为 23000 Da，重链为 46000 Da；2）Minimum Adjacent Charge：6 to 10；3）Mass Tolerance：20 ppm；4）Noise Rejection：99% confidence；5）m/z range：根据原始质谱图中的信号分布进行调整；6）Output Mass Range：根据 target mass 进行调整，最后得到单抗轻重链去卷积后的分子质量信息。

3. 结果与讨论

3.1 源内碎裂（SID）质谱参数对单抗轻重链分子质量测定的影响

影响蛋白分子量测定的因素有很多，包括：流动相、溶液体系（不挥发性盐）、杂质成分、样品浓度、pH 值、样品在源内分解或碎裂、质谱分辨率等情况。在单抗轻重链测定的过程中，我们也会考虑到这些因素，一般我们选用 0.1% 甲酸的水溶液和 0.1% 甲酸的乙腈溶液作为流动相；如果单抗原溶液中含有不挥发性盐，我们建议进行脱盐处理，比如说使用超滤管脱盐，同时如果含有 SDS、Tween 等表面活性剂或者去垢剂最好也进行超滤或者使用其它表面活性剂和去垢剂去除试剂盒进行去除；如果含有杂质成分，也需要根据杂质的组成和性质进行杂质去除；样品的浓度不能太低，否则信噪比低，造成质量误差增大。以上这些参数主要同样品前处理相关，需要作样人员在质谱分析前进行前处理制备。而对于在质谱分析中，可以调节的参数主要是源内碎裂能量（SID），在这里我们就一起探讨一下该参数对轻重链分子质量的影响。

详细质谱参数如表 2 所示，源内碎裂能量（SID）使用 0/30/50/70 和 100 eV 五个不同的电压参数进行数据的采集，轻链的原始质谱图如图 1 所示，重链的原始质谱图如图 2 所示，从图 1 和图 2 中，我们可以看到，随着 SID 能量的增加，轻重链的质荷比分布向高质量端移动，并且在 70 eV 的时候发生了显著的质荷比移动和信噪比的降低，这主要是由于施加的电压增大，轻重链发生降解的可能性增多，以致质谱峰信噪比降低，峰强度降低，而轻链相对分子量比较小，比较简单，因此信号改变不是很明显，但对于重链，我们可以很明显的观察到这个现象。因此在实际样品的测试中，考虑到信噪比和强度这两个重要的因素，我们可以在 0–50 eV 的电压值下进行优化（当然也不排除样品特殊的情况下，我们也可以提高 SID 值进行优化），在 Herceptin 样品的测试中，我们选择 30 eV 进行后续的样品采集和进一步的色谱条件优化。