九大测序平台对比（二）

2.454

企业: Roche

推出时间: 2005年

主流型号: Genome Sequencer FLX Titanium（2008年推出）

样品要求: 5 μg of DNA，浓度≥300 ng/μL

测序原理：焦磷酸测序

在测序时，使用了一种叫做“Pico TiterPlate”（PTP）的平板，它含有160多万个由光纤组成的孔，孔中载有化学发光反应所需的各种酶和底物。测序开始时，放置在四个单独的试剂瓶里的四种碱基，依照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP板，每次只进入一个碱基。如果发生碱基配对，就会释放一个焦磷酸。这个焦磷酸在各种酶的作用下，经过一个合成反应和一个化学发光反应，最终将荧光素氧化成氧化荧光素，同时释放出光信号。此反应释放出的光信号实时被仪器配置的高灵敏度CCD捕获到。有一个碱基和测序模板进行配对，就会捕获到一分子的光信号；由此一一对应，就可以准确、快速地确定待测模板的碱基序列。

文库制备：Fragment(300-800 bp), Mate-pair

模板制备：微乳液PCR

读长：400bp

测序通量：0.4-0.6 Gb/run

时间/run：10 hours

碱基精确度：Q20读长为400个碱基

变异检测能力(DNA重测序方面：SNP, Indel, SV, CNV

成本：仪器$500,000/台，测序$5,600 per whole plate

数据格式：Raw data：SFF格式

分析软件：GS De Novo Assembler软件；GS Reference Mapper软件；GS Amplicon Variant Analyzer软件

优点：突出优势是读长长，使得后继的序列拼接工作更加高效、准确。速度快，一个测序反应耗时10个小时，获得4-6亿个碱基对。

缺点：无法准确测量同聚物的长度，所以检测插入缺失突变的误差率高；通量小且费用高。

经典案例：1.Complete Khoisan and Bantu genomes from southern Africa.Schuster SC et al. (2010) Nature 463(7283): 943-7.

(更多详见https://www.roche-applied-scienc ... ng/genome/index.jsp)

备注：特别适合从头拼接和宏基因组学应用，多用于新的细菌基因组。对重测序来说太贵，不适合

3.Solid

企业: Life Technology(2008年，ABI与Invitrogen合并为Life Technology公司)

推出时间: 2007年

主流型号: Solid™4.0（2010年推出）

样品要求:

• Fragment文库10 ng-5 μg

•Paired-end文库10 ng-5 μg

•Mate-paired文库5 μg-20 μg

测序原理: 边连接边测序

测序引物与接头可以互补杂交，其5‘端可与和邻近序列互补的寡核苷酸相连。八聚体寡核苷酸可竞争性与引物相连接（该寡聚体的第四位和第五位为荧光标记位点）。当其标记颜色被读取后，即将连接上的寡核苷酸在第五位和第六位之间切断，以移除标记，进行下一轮反应，以此依次循环。在第一轮反应中，可以得到确定的碱基位点为：4、5、9、10、14、15位碱基等。重复该反应过程，偏移一位碱基，使用较第一轮少一个碱基的引物进行反应，可以确定的碱基位点包括：3、4、8、9、13、14等，如此往复，直至偏移至引物的第一个碱基（即待测序列0位点碱基）。由于该位点碱基已知，可通过读取的荧光颜色得知位点1的碱基类型，然后，又以位点1碱基荧光颜色推知位点2的碱基类型，依此类推，直至整个序列读序完成。

文库制备:

• Mate-paired 文库 (插入片段 600 bp to 10 Kb)

• Paired-end 文库

• Fragment 文库

模板制备: 微乳液PCR

读长: 2*50 bp

测序通量: 100-120 Gb/run, 12G/day

时间/run: 7~12 days

碱基精确度: 原始碱基数据的准确度大于99.94%，而在15X覆盖深度时的准确度可以达到99.999%

变异检测能力(DNA重测序方面): SNP, Indel, SV, CNV

成本: 仪器$495,000/台，测序$6000/100Gb

数据格式: Raw data: *csfasta和*quel；比对输出格式：BAM/SAM。

分析软件: 分析软件：Bioscope,比对后格式有很多第三方软件支持

优点: 高准确性，每个DNA碱基检测2次，增加了序列读取的准确性

缺点: 运行时间长，检测碱基替换突变的误差率高

经典案例: SOLiD测序技术仅在DNA应用发表的文章共60篇，包括发表在Science/Nature及其子刊上的高水平文章15篇，其中de nove sequencing文章3篇，targeted resequencing文章26篇，whole genome resequencing文章31篇。SOLID在RNA和表观等文章应用也同样广泛。

备注: 行业领先的准确性实现了重要的生物变异检测，适合全基因组重测序、定向重测序和全转录组分析等应用。