转基因食品的检测（二）

(1) 定性PCR法

定性PCR可直接检测启动子、终止子、标记基因片断、目的基因片断。为使目的基因很好的进行表达，在构建基因表达载体时常在目的基因的5’和3’端分别加上启动子和终止子。当前大约75%的转基因植物中使用Ca MV( Cauliflower mosaicvirus) 3 5 S启动子，其次是胭脂碱和章鱼碱合成酶的NOS启动子和Ocs启动子。常用的终止子是胭脂碱合成酶的NOS终止子和Rubisco小亚基基因的3’端区域、所以当前对启动子和终止子的检测实际上是对Ca MV35S启动子和NOS终止子的检测。然而一些植物如十字花科植物易被CaMV感染而携带35S，故检测出阳性信号;而NOS终止子来源于普遍存在的农杆菌(Agrobacterium tume faciens )，因此，用PCR对35S启动子和NOS终止子进行检测时应配合其他检测。定性PCR受DNA抽提和纯化的影响，如果DNA降解或受污染，检测结果就会出现假阳性现象；只能初步确定是否为GMF但不能鉴定是哪种GMF。

(2) 定量PCR法

在实际贸易和食品消费中我们不仅想知道食品是否是转基因的，而且还想知道其中外源基因的含量，即外源基因占GMF的百分含量。在普通的定性PCR扩增过程中，以不同浓度标准阳性样品作参照，标准阳性物用基因工程方法合成，上游引用荧光标记，下游引物不标记，在模板扩增的同时，标准阳性物也被扩增。。最后根据吸光值作出吸光值与转基因含量的标准曲线图，以此可以确定检测样品的转基因含量，这样可以进行半定量检测。

(3) 定量竞争性 QC一PCR法(Quantitative competitive PCR) 

在PCR的反应管中，同时放入用人工合成用荧光标记的模板和待测样品让两者对同一引物同时扩增，反应完成后通过测定荧光强度推测待测样品的DNA含量。

(4) 实时定量荧光PCR法〔11〕

实时定量荧光PCR技术是在常规PCR基础上，添加一条荧光标记基因探针（一般为Taq man）。一个标记在探针的5'端，一个标记在探针的3'端，两者构成能量传递结构，两个荧光集团根据距离控制是吸收或抑制，在PCR不断扩增中不断检测反应体系中荧光信号的变化，通过记录循环次数和PCR体系中起始DNA量的对数值之间的线性关系确定起始DNA的量。用实时定量荧光PCR对转基因食品进行检测可避免普通PCR反应过程中由于外界污染或样品本身DNA降解等原因造成的假阳性结果，但是实时定量荧光PCR仪价格昂贵，检测费用高。

(5)反转录RT-PCR法

 反转录PCR克服了待检样品中外源基因含量特别微量，以mRNA为模板反转录成cDNA，再通过PCR扩增进行检测。

(6) PCR—ELISA法

PCR一ELISA是I种将PCR高效性与ELISA高特异性结合在一起的转基因检测方法。利用共价交联在PCR管壁上的寡核普酸作为固相引物，在Taq酶作用下，以目标核酸为模板进行扩增，产物一部分交联在管壁上，为固相产物，一部分游离于液体中，为液相产物。对于固相产物，可用标记探针与之杂交，再用碱性磷酸酷酶标记的链亲和素进行ELISA检测，同时可通过凝胶电泳对液相产物进行分析。将PCR和ELISA两种方法相结合，可以相互取长补短，使检测的准确性大大提高。目前在我国尚未建立统一完备的转基因食品的筛选方法，随着转基因食品的数量增多及我国加入世界贸易组织，在我国建立转基因食品的筛选方法将对人群健康及生态环境的保护起积极的作用。

Southern杂交

Southern杂交技术在分子生物学中用于基因组DNA特定序列定位。在转基因食品中用Southern技术，是要在知道该转基因食品转入外源基因片断的情况下使用。以放射性或荧光标记的外源目的基因的同源序列作为探针与该食品原料农产品的总DNA进行杂交。首先用限制酶消化受体总DNA，通过琼脂糖凝胶电泳按大小分离所得的片断，随后使DNA在原位发生变性，并从凝胶转移至一固相支持体上。DNA转移至固相支持体的过程中，各个DNA片断的相对位置保持不变，用放射性或荧光标记的探针与各个DNA片断杂交，经放射自显影确定与探针互补的电泳条带的位置。Southern技术用于食品外源基因的检测可检测出外源基因与内源基因有高度同源性的DNA片断，且准确可靠，但对样品的纯度要求较高，费用也较高。

基因芯片

基因芯片〔12〕是20世纪80年代末在生命科学领域中迅速发展起来的一项高新技术，是由大量DNA或寡核苷酸探针密集排列的矩阵，基因芯片可以将目前通用的报告基因、抗性基因、启动子和终止子的特异片段(靶片段)固定于玻片上制成检测芯片，将从待检样品中提取的DNA扩增、标记后与芯片进行杂交，杂交信号由芯片扫描仪检测，再经计算机软件进行分析判断,其基本原理为通过杂交检测信号。基因芯片技术可对样品进行集约化和平行处理。利用基因芯片可实现对DNA的准确、快速、大信息量的检测。从而方便、快速地对大量待检测转基因作物进行灵敏、准确的检测。        

其不足之处是每种检测样品首先必须有与之相配的非转基因作物的芯片。

 2. 基因转录水平检测

northern印迹杂交

将northern技术用于外源基因的测定可测定特定外源基因DNA的转录产物mRNA分子的大小和丰度。RNA分子在变性琼脂糖凝胶中按其大小不同而相互分开，随后将RNA转移至活化纤维素、硝酸纤维素滤膜上。用放射性标记的外源DNA探针或RNA探针进行杂交和放射自显影，确定外源DNA的转录产物RNA。

3. 基因翻译表达水平的检测

1. 酶联免疫吸附反应(EL ISA)技术

酶联免疫吸附试验(E nzy me一Linked Immunosorbent Assay, EL ISA)用于检测表达的目的蛋白，其基本原理是抗原抗体的特异性结合和酶对底物的高效催化。将针对目的蛋白的抗体包被在ELISA板上，加入待测物的溶液，经保温如待测物中含有转基因片断的表达产物即相应的蛋白，该蛋白作为抗原与包被的特异性抗体相结合。加入酶标记的针对目的蛋白的抗体，再经保温后加入酶反应底物显色，以酶联阅读仪测定OD值。

2. 蛋白芯片

蛋白芯片的操作过程和基因芯片是一样的，只是其原理是利用抗原抗体的特异性结合而不是碱基对的互补杂交。

3. Westertern印迹法

Western印迹法的原理和Southern杂交、northern印迹杂交的原理相似，是抗原抗体的特异性结合。把从样品中提取的蛋白质用凝胶电泳分离成大小不同的分子作为抗原，并将其转移到固体支持物上，用含有放射性标记的抗体做探针与之杂交，通过放射性自显影检测外源基因的表达产物。Western印迹法与EL ISA所用都是抗原抗体的特异性结合，标记探针不同而已。一个为放射性标记，一个为酶标记。

转基因食品检测的发展方向和趋势

由于转基因食品直接关系到人们的身体健康和切身利益，所以对转基因食品的检测要求快速、准确、实用、操作简便。转基因食品的检测正朝着试剂盒的方向发展，DNA芯片技术在未来的转基因检测中的作用也越来越突出。


参考文献
(1) Clive James，译者:张银定，王琴芳。生物技术通报， 2001，3，41
(2) 杨少辉，张丽娟，马峙英，王静华 。 河北农业大学学报，2002，5，
(3) 赵文军，陈红运    植物检疫   2001，5
(4) 陈向荣，吉前华，孔祥文。生态科学，2003，（22）2
(5) 陈永红，李哲敏，许世卫。专家论坛
(6) 刘谦，朱鑫泉主编 生物安全
(7) 李宏伟，全球科技经济了望
(8) 欧盟与美国规范转基因为何不同，粮食与油脂
(9) 张启发，中国大学教学
(10) 美国 萨姆布鲁克等 金冬雁 等译 分子克隆 第二版
(11) 马荣群，陈红运等 植物检疫，2002，1
(12) 马立人，蒋中华。《生物芯片》，第二版，2002
(13) 黄迎春，孙春昀 等遗传,2003，（25），3
(14) Markus L，Peter B. IUPAC collaborative trial study of a method to detect genetically modified soybeans and maize in dried powder J.AOAC Inter.1999 ,84(4)
(15) 缪海珍，朱水芳，张谦等复旦学报(自然科学版) 2003，（42）4
(16) 贾士荣.转基因作物的安全性争论及其对策「J」.生物技术通报，1999( 6) 
(17) 吕山花，邱丽娟 生物技术通报，2002，4
(18) 孙雷心.1999年全球转基因作物商品化概述「J」.生物技术通报，2000(3) :39-41. 
(19) 中国科学院学部“我国转基因作物研究和产业化发展策略”咨询组  中国科学院院刊
(20) E Gachet，G G Martin. Detection of Genetically Modified Organisms(GMO) by PCR. Trends in Food Science and Technology，1999 ,9 
(21) 陈守春。国外医学流行病学传染病学分册，1999     
(22) 刘光明，苏文金 集美大学学报(自然科学版) 2001，3
(23) http//www.isaaa.org
(24) 杨文友, 中国国境卫生检疫杂志, 2001, (24),1
(25) 邓平建，赵锦，刘建军.中国卫生检验杂志,2003, (13) 10
(26) 苏贤坤，张晓海 农业现代化研究，2004，1