1.7 抗体纯化
1.7.1 多克隆抗体的纯化采用辛酸-饱和硫酸铵法纯化抗β-内酰胺酶的兔血清，2次滴加饱和硫酸铵的最终体积分数分别为50%和40%。将沉淀用少量PBS溶解后转入透析袋中，用PBS溶液透析48h，利用紫外分析法检测透析液直至透析完全。
1.7.2 单克隆抗体的纯化采用PEG6000沉淀法纯化Balb/C小鼠的腹水，沉淀用50mmol/LTris-HCL溶液（pH8.0）溶解，冰浴除杂蛋白，即得粗提单克隆抗体，用SDS-PAGE对抗体纯度进行鉴定。
2 结果与分析
2.1 免疫原
通过SDS-PAGE分析β-内酰胺酶和青霉素酶，两种蛋白的分子质量及纯度见图1。两种蛋白在分子质量为30ku处均有明显的蛋白表达，分子质量数据与预期相符。β-内酰胺酶经SDS-PAGE分析，纯度达100%，与说明书一致。青霉素酶经Bandscan软件分析，纯度达61.4%，含有大量杂蛋白。使用纯度较好的β-内酰胺酶作为免疫原。
2.2 兔抗β-内酰胺酶多克隆抗体效价
4免后，3只日本大耳兔的效价分别为1×106，2×106，1×106（见图2）。其中2号大耳兔的效价最高，选取2号大耳兔的血清做ELISA的优化实验。
2.3 ELISA筛选方法
2.3.1 包被原浓度采用方阵法，用系列浓度稀释的青霉素酶横向包被96孔酶标板，将倍比稀释的一抗纵向加入（用"+"表示），每组加入50μg/mL的青霉素酶做抑制试验（用"-"表示），使用间接ELISA法确定最佳抗原包被浓度。当包被原质量浓度为5μg/mL，兔血清质量浓度为1∶64000时，OD450 接近1，且抑制效果最好。使用5μg/mL青霉素酶作为包被原。
2.3.2 包被条件选择4℃overnight，37℃1h，37℃ 2h 3种方式包被，以确定最佳包被条件。根据P/N的比值，确定4℃overnight为最佳包被浓度。
2.3.3 青霉素酶结构复杂，含杂蛋白。7种封闭液中，使用3%BSA+0.05%吐温+3%蔗糖封闭，特异性最好，封闭效果最佳。
2.3.4 封闭时间采用间接ELISA确定最佳封闭时间。当封闭时间2h时，阴性值较低，P/N比值为最大，封闭效果最佳。
2.4单克隆抗体的制备
2.4.1 BALB/C小鼠免疫效果从免疫结果看，低剂量组（50μg/只）Balb/C小鼠产生抗体的效价最高，达1:128000。同时比较Balb/C小鼠的精神状态，低剂量组较中、高剂量组的Balb/C小鼠体态活跃，被毛光亮。使用低剂量组的Balb/C小鼠脾脏进行融合。
2.4.2 细胞筛选及亚克隆细胞融合后， 融合率为80%，阳性率为20.5%。经4 次亚克隆，阳性率为100%，筛选出能稳定分泌抗β-内酰胺酶抗体的3株阳性细胞株，分别命名为C1，D1，F8。将F8连续传代3 周及冻存复苏后，检测ELISA 效价，结果基本不变，说明所获杂交瘤细胞株稳定。
2.5 抗体特性分析
2.5.1小鼠腹水中单抗效价及亲和力测定结果用间接ELISA法检测3株杂交瘤细胞无血清培养基上清效价（1∶32）～（1∶512）。将3株杂交瘤细胞均腹腔注射获取腹水，3株杂交瘤细胞株中F8腹水的效价最高，选择F8做后续实验。采用非竞争酶免疫试验进行测定。经亲和力常数公式计算，F8的亲和力为6.4×107L/mol。
2.5.2 3株杂交瘤细胞亚型的鉴定结果使用单克隆抗体亚型鉴定试剂盒，对筛选出的3株单抗C1，D1，F8进行亚型鉴定，这3株杂交瘤细胞均属于IgM 亚型。
2.5.3 F8杂交瘤细胞株染色体的分析 计数100体数目总和基本一致（已知SP2/0细胞染色体数个处于有丝分裂中期的完整F8细胞，染色体数目62～68条，Balb/C小鼠脾细胞的染色体数目为96～104条（图7），与SP2/0细胞和脾细胞的染色40条）。
2.5.4 Western-Blotting检测F8的特异性Westernbloting鉴定表明，F8 腹水可与β-内酰胺酶和青霉素酶发生特异性反应（图8），说明F8是针对β-内酰胺酶和青霉素酶的特异性抗体。
2.6 F8杂交瘤细胞株单克隆抗体的纯化
比较了辛酸-冷酒精法、辛酸-饱和硫酸铵法、PEG60003种方法，经PEG6000方法纯化的单克隆抗体虽然纯度不高，但抗体效价保存最好。
3讨论
金属β-内酰胺酶是一类活性依赖二价金属阳离子的β-内酰胺酶，该酶广泛水解（包括碳青霉烯类、广谱头孢菌素类等）多种β-内酰胺类抗生素，对常用 β-内酰胺酶抑制剂（如克拉维酸、舒巴坦等）不敏感。依据分子生物学，Bush于1997年将当时有序列资料的12种金属酶分成3个亚群：B1，B2，B3。绝大多数金属酶属于B1亚群，该亚群的各种酶分子质量相近（约为28ku），序列一致性大于23%。B2亚群与B1亚群的分子大小相近，但同源性较低。B3亚群只有9个氨基酸与其它金属酶显著不同，单体分子质量为31.7ku。虽然各亚群金属酶之间的氨基酸序列同源性不高，但是酶蛋白形成的立体结构却很类似，金属酶中的关键残基，尤其是形成金属键的氨基酸残基高度保守。鉴于β-内酰胺酶的结构特点，选择纯度较好的β-内酰胺酶作为免疫原。为了使筛选的单克隆抗体能更好地识别β-内酰胺酶，使用中检所的青霉素酶作为包被原。目前，市售β-内酰胺酶检测胶体金试纸条多数采用的是间接法。间接法是利用β-内酰胺酶酶解青霉素的原理，将牛奶样品与微量青霉素混匀反应。如果牛奶中存在一定浓度的β-内酰胺酶，那么青霉素经β-内酰胺酶酶解后浓度减少。用试纸条检测青霉素，判断牛奶中是否存在β-内酰胺酶，但是待测样品要经过多次离心、孵育等工序处理后方可使用试纸条进行检测。而本研究通过研制抗β-内酰胺酶的单克隆抗体和多克隆抗体，使用双抗夹心法，胶体金试纸条直接检测。该方法的优势是减少反应时间，优化反应步骤。
另外，细菌耐药也能产生内源性β-内酰胺。牛奶中内源性β-内酰胺酶的来源主要有2种途径：一是牛体本身产生的，二是牛本身感染的某些有抗性的微生物在体内不断分泌表达β-内酰胺酶。目前尚未有能区分产品中所含β-内酰胺酶是人为添加还是耐药细菌产生的报道，这是监管β-内酰胺酶的一个新难题。只有加强畜牧业、奶业生产全过程管理，提高养殖人员的安全责任心，才是消除抗生素残留，保障牛奶和奶制品安全的根本。
