三叶青(Tetrastigma hemsleyanum Diels et. Gilg)是葡萄科崖爬藤属植物,具有多种功效,是颇具前景的药用植物资源。但是,有关三叶青的抗氧化、抑菌活性与诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡作用机理研究尚未有报道,因此,本文对三叶青萃取物的生物活性及其诱导HeLa细胞凋亡作用机理进行了相关研究,研究结果如下：1.采用经典的天然药物化学提取、系统溶剂分离方法对三叶青块根进行提取分离后得到Ⅰ石油醚萃取物(Petroleum Ether Fraction, PEF)、Ⅱ氯仿萃取物(Chloroform Fraction, CFF)、Ⅲ乙酸乙酯萃取物(Ethyl Acetate Fraction, EAF)、Ⅳ正丁醇萃取物(n-Butanol Alcohol Fraction, BAF) 、V水萃取物(Aqueous Fraction, AF)。2.采用DPPH法、ABTS法、FRAP法系统地评价了三叶青各萃取物的抗氧化活性。结果表明,在0.25 mg/ml-2.0 mg/ml浓度范围内,EAF萃取物显示出较强的抗氧化活性；进一步采用柱层析、重结晶等方法,对EAF萃取物的化学成分进行分离纯化,最终得到2个化合物,鉴定为槲皮素和β-谷甾醇。3.本研究选用了金黄色葡萄球菌CLMA 1213)、枯草芽孢杆菌(LMA 0106)、大肠杆菌(LMA 1226)、沙门氏菌(LMA 0217)、肺炎克雷伯杆菌(LMA 0725)5种细菌,总状毛霉(LMA 3221)、桔青霉(LMA 7126)、米根霉(LMA 2429)、黄曲霉(LMA0816)和黑曲霉(LMA 3601)5种霉菌作为测试菌。研究结果表明,CFF萃取物对金黄色葡萄球菌(LMA 1213)以及枯草芽胞杆菌(LMA 0106)的抑制能力最强,MIC值为62.5 μg/ml;EAF萃取物对大肠杆菌(LMA 1226)、沙门氏菌(LMA 0217)、肺炎克雷伯杆菌(LMA 0725)的抑制作用较强,MIC值的范围在125 μg/ml-250 μg/ml之间：CFF萃取物对霉菌的抑制作用最强,MIC值的范围在31.3 μg/ml-125 μg/ml之间。4.本研究采用MTT法筛选出三叶青CFF萃取物、PEF萃取物和EAF萃取物对人宫颈癌HeLa细胞具有较强的抑制作用,其IC50值分别为8.59 ± 0.98 μg/ml、121.40±1.27 μg/ml和148.54 ± 1.78 μg/ml,BAF萃取物和AF萃取物对HeLa细胞的抑制作用较弱。三叶青萃取物对人肾上皮HEK-293细胞增殖无明显抑制作用。5.PEF萃取物和CFF萃取物可使HeLa细胞的乳酸脱氢酶(LDH)释放率显著增加(p0.01),表明两者均能导致HeLa细胞损伤的发生。但低浓度EAF萃取物未检测到LDH释放,直到浓度达到160 μg/ml时才出现LDH释放率的增加,但结果远低于PEF萃取物和CFF萃取物,表明EAF萃取物未对HeLa细胞造成明显损伤。6.本研究探讨了PEF萃取物和CFF萃取物诱导HeLa细胞的凋亡作用。实验表明,在10μg/ml、 20μg/ml和40 μg/ml PEF萃取物和CFF萃取物作用下,HeLa细胞的早期凋亡率、△ψm损失率显著下降,和对照组相比,结果具有显著性差异(p0.05)。PEF萃取物和CFF萃取物对HeLa细胞具有特异性细胞周期阻滞作用,阻滞作用分别发生在G2/M期和G0/G1期。PEF萃取物和CFF萃取物可以激活Caspase-3、 Caspase-8、 Caspase-9蛋白酶的表达,表明PEF萃取物和CFF萃取物通过线粒体途径诱导了HeLa细胞凋亡,死亡受体凋亡途径也可产生协同作用。PEF萃取物和CFF萃取物均能导致SOD、CAT、GSH-pX酶活性下降,MDA含量增加,表明氧化应激参与了三叶青萃取物诱导HeLa细胞凋亡过程。7.本研究采用GC-MS分析了三叶青PEF萃取物的化学成分,共检出80个色谱峰,鉴定了其中的30个化合物。结果显示,PEF萃取物中脂肪酸和甾醇的含量较高,主要包括棕榈酸15.67%,亚油酸16.54%,油酸17.72%,麦角甾醇1.58%,β-谷甾醇10.29%。
