凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA)是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术,可用于定性和定量分析。这一技术zui初用于研究DNA结合蛋白,目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。
通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温,在非变性的聚丙烯凝胶电泳上,分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同,可是双链或者是单链。当检测如转录调控因子一类的DNA结合蛋白,可用纯化蛋白,部分纯化蛋白,或核细胞抽提液。在检测RNA结合蛋白时,依据目的RNA结合蛋白的位置,可用纯化或部分纯化的蛋白,也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段(特异),和其它非相关的片段(非特异),来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下,依据复合物的特点和强度来确定特异结合。
重要试剂:
Boitin-N4-CTP (invitrogen # 15918-18)
TdT (NEB # M0252L)
Poly(dI.dC) (sigma #P4929)
Hybond-N 尼龙膜 (Amersham #RPN303B)
发光底物 (宁波 唯奥)
缓冲液:
Buffer A (store at 4℃)
Hepes (pH7.9) 10mM
KCl 10mM
EDTA 0.1mM
DTT(fresh added) 1mM
PMSF(fresh added) 0.5mM
Buffer B (store at 4℃)
0.5M EDTA in PBS (pH7.4)
Buffer C (store at 4℃)
Hepes (pH7.9) 20mM
NaCl 0.4M
EDTA 1mM
DTT(fresh added) 1mM
PMSF(fresh added) 1mM
Buffer I (store at RT)
Tris (pH7.5) 0.1M
NaCl 1M
MgCl2 2mM
Buffer II (pH7.5) (store at RT)
马来酸 100mM
NaCl 150mM
Buffer III (store at RT)
Tris(pH9.5) 100mM
NaCl 100mM
MgCl2 50mM
Blocking Buffer (store at 4℃)
0.3%Tween-20, 0.3%Triton X-100, 5%BSA in Buffer I
Wash Buffer
0.3%Tween-20 in Buffer II
20×SSC (1L pH7.0)
NaCl 175.3g
柠檬酸钠 88.2g
10×Binding Buffer (store at -20℃) [在公司(碧云天)购买:5×binding buffer,内含Poly(dI.dC)]
Tris (pH7.5) 0.1M
KCl 0.5M
DTT 10Mm
Poly(dI.dC) (store at -20℃)
1mg/ml in TE (pH7.5)
SA-HRP(储存液store at -20℃ 工作液store at 4℃)
1mg/ml in 50%PBS (pH7.2) 50%Glycerin
5×TBE (5L)
EDTA 18.612g
硼酸 139.1175g
Tris 272.565g
5×TdT Reaction Buffer (store at -20℃) (pH7.2)
Sodium cacodylate 0.5M
CoCl2 10mM
TCEP 1mM
Biotin-N4-CTP (store at -20℃)
Biotin-N4-CTP 50mM
Tris (pH7.5) 10mM
EDTA 1mM