五、细胞培养和刺激的基本方法
细胞活化的最终结果是产生细胞因子,根据检测指标和标本的不同,研究人员需要选择不同的刺激剂和刺激时间,以获得最佳的实验结果。下表提供了检测一些常用细胞因子的推荐的活化方法。
表1、细胞内细胞因子流式检测推荐的阳性对照活化方法
检测细胞因子 | 阳性对照刺激方法 |
人IFN-g | 方法2 (4-24 小时) |
人TIMP-1 | 方法5 |
人aTNF- | 方法7 (6 小时) |
人IL-1a | 方法3 (6 小时) |
人bIL-1 | 方法3 (24 小时) |
人IL-2 | 方法2 (4-24 小时) |
人IL-4 | 方法4 |
人IL-5 | 方法1 |
人IL-6 | 单核细胞:方法3 (6-12 小时) T细胞:方法6 |
人IL-10 | 方法1 |
人IL-12 | 方法8 |
人IL-15 | 方法3 |
人Fractalkine/CX3CL1 | 方法1 |
人IL-8/CXCL8 | 方法3 (24 小时) |
人MCP-1/CCL2 | 方法3 (24 小时) |
人MIP-1a/CCL3 | 方法3 (24 小时) |
人MIP-1b/CCL4 | 方法3 (24 小时) |
人RANTES/CCL5 | 方法1 |
小鼠IL-2 | 方法9 |
小鼠IL-4 | 方法10 |
小鼠IL-5 | 方法10 |
小鼠IL-6 | 方法11 |
小鼠gIFN | 方法9 or 方法12 |
小鼠aTNF- | 方法9 |
为防止细胞内细胞因子分泌到胞外,在培养的最后4-6个小时,需要使用蛋白转运抑制剂(如3uM monensin,10mg/ml的BFA)
方法1:只使用转染细胞检测
方法2:人的PBMCs使用PMA (10 ng/ml) 和Ionomycin (1 uM) 刺激4-24 小时.
方法3:人的PBMC 使用LPS (0.5 - 1 ug/ml) 刺激24 小时.
方法4:人的PBMCs或者纯化的CD4+细胞在包被人CD3抗体的培养板中,使用含有重组人的IL-2(10 ng/ml,目录号202-IL-010)和IL-4(10 ng/ml,目录号204-IL-005)的培养基培养两天;细胞洗涤后在含有重组人IL-2和IL-4的培养基中继续培养2天;最后收获细胞,使用PMA(10 ng/ml) 和Ionomycin (1 uM)刺激6小时20mL于Falcon管中,加入100mL激活后的全血(细胞浓度维持在2×106/mL) 混匀,室温暗处孵育15分钟;
方法5: CD4 T 细胞使用PHA (10 ng/ml) 刺激4 days
方法6: T 细胞使用抗CD3 的单抗、抗CD28的单抗和重组人的IL-1b (Lorre, et al., 1994, Clin Immuno Immunopath 70:1)
方法7: 使用PMA (50 ng/ml) 和Ionomycin (500 ng/ml)刺激
(10 ng/ml,目录号285-IF-100) 刺激2 小时,然后使用IFN(10 ng/ml) LPS(1 ug/ml)刺激22小时或者使用相同的方法刺激THP-1 细胞.g方法8: PBMCs细胞使用重组人IFN
方法9: EL4 在包被抗小鼠CD3抗体(25 ug/ml)的培养板中,使用抗CD28抗体(2 ug/ml) PMA(5ng/ml) Ionomycin(500 ng/ml) 刺激6小时
方法10:CD4+T细胞在包被小鼠CD3(25ug/ ml)抗体的培养板中,使用含有抗小鼠的CD28(2 ug/ml)的抗体,重组小鼠的IL-2(10 ng/ml,目录号402-ML-020)和IL-4(50 ng/ml,目录号404-ML-005)的培养基培养两天;然后在含有重组小鼠IL-2和IL-4的培养基中继续培养3天;最后收获细胞,使用PMA(5 ng/ml)、Ionomycin(500 ng/ml)和monensin刺激6小时。
方法11: 小鼠ip巨噬细胞使用Mouse ip 1 ug/ml LPS 刺激24小时
方法12: 小鼠脾细胞使用PMA(5 ng/ml)和Ionomycin(500 ng/ml)刺激6小时
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