= 细胞培养基本方法 =
(一)准备和安装过滤器 (二)合成培养基的配制 (三)小牛血清的处理 (四)生长培养基的配制
(五)冻存细胞的复苏 (六)传代 (七)冻存 (八)注意事项
(一)准备和安装过滤器
清洗好过滤器,干燥,放入一张孔径0.22μm的微孔滤膜,用布包装好,15磅20 min进行高压灭菌处理。 在超净台内打开过滤器架好,胶管一端接入滤泵再插入待除菌的液体中,出口端胶管深入到已消毒好的瓶子中。用泵过滤,过滤后要检查滤膜是否完好无损。
(二)合成培养基的配制
1、根据细胞目录中的说明,按下表选择合适品牌及货号的培养基干粉,用适量超纯水充分溶解。
培养基 | 品牌 | 货号 |
D-MEM/F-12 | GIBCO | 12400024 |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM), powder (high glucose) | GIBCO | 12800017 |
F-12 Nutrient Mixture (Ham) powder | GIBCO | 21700075 |
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) powder | GIBCO | 12200036 |
Leibovitz's L-15 Medium powder | GIBCO | 41300039 |
McCOY's 5A | SIGMA | M4892 |
Minimum Essential Medium (MEM) Alpha Medium powder (MEMα) with ribonucleosides and deoxyribonucleosides | GIBCO | 11900024 |
Minimum Essential Medium (MEM) Alpha Medium powder (MEMα) without ribonucleosides and deoxyribonucleosides | GIBCO | 12000022 |
Minimum Essential Medium (MEM) powder | GIBCO | 41500034 |
NUTRIENT MIXTURE F12 HAM KAIGHN'S MODIFICATION (F12K) | SIGMA | N3520 |
RPMI Medium 1640 | GIBCO | 31800022 |
EGF | SIGMA | E9644 |
Sodium pyruvate | SIGMA | P2256-25G |
MEDIUM 199, WITH EARLE'S SALTS AND L-GLUTAMINE, WITHOUT SODIUM BICARBONATE. CELL CULTURE TESTED | SIGMA | M5017 |
2、 按要求添加碳酸氢钠、谷氨酸钠、HEPES等,充分搅拌使之溶解。
3、 调 pH至7.2左右。
4、 加水至最终体积。
5、 在超净台中对溶液进行滤过除菌,分装入250 mL或500 mL玻璃瓶中,用翻帽塞塞紧瓶口。
6、 瓶口封好,4℃冰箱贮存。
(三)小牛血清的处理
市场上出售的小牛血清一般做了灭菌处理,但在使用前还应做热灭活处理,即通过加热的方法破坏补体(近来也有观点认为热灭活处理是不必要的)。胎牛血清不必灭活。
1、 将血清加热至56℃并保持30 min,其间要不时轻轻晃动,使受热均匀,防止沉淀析出。
2、 处理后的血清贮存于4℃。
3、 小牛血清在使用前最好进行筛选以掌握血清的质量。
(四)生长培养基的配制
除无血清培养之外,各种合成培养基在使用前需加入一定量的小牛血清或胎牛血清和抗菌素。
培养基分装成小瓶(100~200 mL)以便使用,翻帽塞塞紧瓶口。
按如下比例配制: 基本培养基占80%~90%,小牛血清或胎牛血清占10%~20%。 按1%体积分数加入双抗贮存液(青霉素+链霉素),使青霉素和链霉素的终浓度分别为100 U/mL和100 μ/mL,。
(五)冻存细胞的复苏
应遵守慢冻快融的原则。先将水浴锅调至37-37。5度,取出冻存的细胞迅速放入后将细胞面浸至水面以下不断摇动至融化。
在无菌台内将完全培养基加入50ml的小培养瓶内,约5ml左右,然后用无菌吸管从冻存管内取出细胞,置培养并内轻轻摇晃,使细胞均匀后置培养箱内培养。
(六)传代:
贴壁细胞:
对于贴壁细胞应先吸(倒)尽培养基,吸的越干净越好,以免中和后加入的消化液,使强度减弱(或PBS洗1-3次)。50ml培养瓶加入消化液约1-3ml,按此比例进行消化,(根据经验),晃动使消化液铺均匀置37度培养箱约2-5分钟,镜下见细胞收缩变圆或少数脱落后,轻轻振动瓶底使细胞全部脱落,加入2-3ml完全培养基后,轻轻吹打,使细胞基本成单个悬浮,然后分置其它无菌培养瓶内,加入完全培养基后继续培养或实验。
悬浮细胞:
一般传代可直接将细胞原液分置其它培养瓶内,加入完全培养基继续培养,如要高浓度可先离心1000rpm,5min后加入完全培养基,轻轻吹匀后,分置其它培养瓶内加入完全培养基继续培养。
(七)冻存
将贴壁细胞消化后离心收集,悬浮细胞直接离心收集,以完全培养基或胎牛血清重悬细胞至终浓度约106/ml。加入10%的DMSO。以每管1~2ml分装至冻存管中。用绝热材料包裹置-70摄氏度冰箱冷冻过夜。次日保存到液氮中。
(八)注意事项
玻璃吸管和玻璃培养瓶的消毒:1)高压蒸汽灭菌15分钟以上;2)干烤消毒140度2小时以上;
无菌工作台先清洗后用75%酒精擦拭干净,紫外线照射40分钟以上;各种培养板照射3小时以上;
培养基(pH7.2)和血清配制好后要做无菌试验:将血清按10%加入培养基内,用无菌的玻璃离心管或玻璃瓶取完全培养基5-10ml置培养箱内培养2-3天,肉眼见无浑浊或沉淀等异物。分装后置4度保存;
消化液(pH7.8)或其它加入液,应用高压蒸汽灭菌或一次性无菌滤器过滤除菌,分装成支置-20度保存;
培养箱应先用清水清洗后用75%酒精擦拭一遍(如有紫外线的应照射1小时以上,如有高温灭菌的应按程序来菌)。至少每月一次。
进入操作时应注意先清洗双手及手腕,然后用75%酒精擦拭,操作时注意无菌台内空间层次。手及物品不要在暴露的瓶口上方来往,如果数量较多,培养瓶应放在与酒精灯平行地方便于操作,瓶与瓶之间应相隔一定的距离,开瓶(盖)时应先用75%酒精反复擦拭或用灯烧,打开后应用灯先烧口,然后烧盖。用完后同样操作。整个操作过程尽量在无菌台靠里面一点。
科学家们已经成功地大规模生产了实验室培养的脂肪组织,这反映了自然衍生的动物脂肪的纹理和组成。最近发表在《eLife》杂志上的这一发现可用于制造细胞培养的肉类,增强其质地和味道,使之与传统肉类非常相似。......
创造实验室培养的肉的挑战之一是使其具有与真实事物一样的质地。一种新的细胞培养支架可能会有所帮助,因为据说它价格低廉、可以食用,而且是由植物性物质制成。在生产培养肉时,科学家通常会从某种类型的动物(如牛......
总的原则:无菌操作、保证细胞培养环境的稳定性按时间顺序整理1、细胞房和生物安全柜(或超净工作台)先开紫外照射30min。作用:对环境灭菌(空气)。(备注:如果着急,至少也要开15分钟)在做实验之前考虑......
2018年12月,瑞士生物科技巨头LONZA(龙沙)集团最近在以色列海法的生命科学园开设了新的以色列协同创新研发中心(CIC)。中心旨在利用以色列在软件和细胞/分子生物学和工程方面的前沿专业技术,提高......
培养细胞就像养育BABY一样,要精心照料,用心呵护。最好每天都去看看它们,满足它们所需要的物质需求,防止出现培养箱缺水、二氧化碳不足、温度不够等各种小意外,还要注意很多小细节,以免开展重复的实验导致不......
问世间谁人无忧,唯神仙逍遥自在。作为一名终日泡在实验室的实验君,如何在细胞实验中无所不能,超脱轮回做到一个人人羡慕的细胞大神呢?且看向这里,成为细胞大神的六个细节。1.过滤体系自从出现瓶装培养基之后,......
分析测试百科网讯2018年6月20日-22日,由欧洲博闻展览咨询有限公司、中国医药保健品进出口商会主办,上海博华国际展览有限公司协办的第十八届世界制药原料中国展——CPHIChina2018在上海新国......
分析测试百科网讯岛津科学仪器公司(SSI)宣布推出细胞培养基分析平台C2MAPTM-2000,这是一款全自动化和集成化的样品制备工作站,用于分析细胞培养基。C2MAP系统测量培养上清液中95种成分(包......
一个生物药的诞生,从发现/筛选到商品化需要很长时间,其中靶标发现和验证靶标消耗的时间就需要几周。最近,SCIEX在其2018年年会期间推出一款颠覆传统筛选方法的新型生物制品分析仪C100HT,它将为生......
分析测试百科网讯SCIEX是生命科学分析技术领域的全球领导者,2018年1月30日在马萨诸塞州弗雷明汉宣布推出新C100HT,用于生物制药领域的定量糖基筛选。结合使用SCIEX的获奖技术快速糖基化学(......