叶绿体DNA分离

设备：Hitachi CS-150GXL或CS-120GXL微量超速离心机，S100AT6 转头，5PA 密封管（如果用4PC管，可接比例减少各层液量）
溶液配制：
A液：0.35Msorbitol（山梨醇），50mM Tris—Hcl (PH8.0) 25mM EDTA—Na2
B液：5％（w/w）Sodium N—lauroyl Sarcosinate  (N—月桂肌氨酸钠)
方法：CsCl 平衡等密度离心方法 （equilibrium isopycnic）
分离步骤：
1．5ml 叶绿体稀释加5ml A液
2．CF7D2 或同类离心机 2500rpm 4℃，15分钟，50ml ，PP管
3．（2）的沉淀加20—30ml  A液“洗”2—3次（用（2）参数离心2—3次）
4．（3）的沉淀加2ml A液及 pronase (链霉蛋白酶)
5．培养：37℃，2小时。取出后室温平衡2分钟
6．混合器混匀（15分钟）
7．再培养4℃，（2—3）小时
8．离心：2500rpm，4℃，15分钟，上清液为粗制DNA液
9．超速离心加样：5 ml 密封管，样品（（8）的上清）3.61 ml 加入3.35g CsCl，E.B （ethidium bromide） (澳化乙锭) （10mg/ml）：50ul。溶液CsCl密度为ρ＝1.55g/cm3 ，混匀后密封（用日立STF2自动熔封器）
注：以上是单管配置，如配双管或多管，则所有步骤容量都增加倍数。
10．离心：日立CS—150GXL或CS—120GXL 离心机或同类机型S100AT6转头，5ml密封管。70,000rpm（约296,000xg，K＝37），离心16小时，20℃，加速“9”，减速“7”。
注：由于对同一样品离心时间与K近似值成正比，使用其他型号转头可参照实际的K值决定离心时间
11．结果：在离心管中部可见明显的宽约2mm的叶绿体DNA条带，用讲座文章3a篇中的方法取出。