高灵敏度化学发光技术应用心得（一）

一．概述

化学发光 (ChemiLuminescence ，简称为 CL) 分析法是分子发光光谱分析法中的一类，它主要是依据化学检测体系中待测物浓度与体系的化学发光强度在一定条件下呈线性定量关系的原理，利用仪器对体系化学发光强度的检测，而确定待测物含量的一种痕量分析方法。化学发光与其它发光分析的本质区别是体系产生发光 ( 光辐射 ) 所吸收的能量来源不同。体系产生化学发光，必须具有一个产生可检信号的光辐射反应和一个可一次提供导致发光现象足够能量的单独反应步骤的化学反应。

化学发光Western 杂交检测，是同位素检测的一种高度灵敏的替代方法。酶标记抗体取代了放射性标记抗体，当它作用于底物时，可产生光信号。多数特异抗原检测方法以辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)二级抗体耦联物为基础。信号可通过感光胶片或专用的成像设备来采集。化学发光底物用于免疫印迹技术已有十几年的历史，目前大部分实验室做转印时都会采用化学发光技术进行检测。随着冷CCD化学发光检测技术的发展，现在越来越多的实验室都开始采用冷CCD的凝胶成像系统进行化学发光的检测，胶片成像虽然比自然发光法灵敏度更高，但也有很多缺点：耗时，需要暗房，显影剂和胶片，胶片较贵且为需持续购买的消耗品。同时由于胶片的线性范围较窄，因此用胶片上的条带（特别是表达量较低的条带）进行定量几乎不可能。冷CCD技术与X胶片相比具有瞬时影像处理、高灵敏度和高分辨率、动力范围广等优点，因此能对条带进行精确定量。当然这项技术要求底物能产生高强度长持续时间的信号，以保证信号能被冷CCD的凝胶成像系统捕获。在这方面多家公司都提供了相应的化学发光底物或试剂盒，特别是Bio-Rad公司提供的Western-C化学发光检测试剂盒，底物可产生高强度的持续光信号24小时，因此用户可以进行多次曝光，最低可检测至10^-19mol，配合Bio-Rad屡获大奖的化学发光成像系统ChemiDoc XRS或VersaDoc系统能得到得到高质量的印记信号。

我们实验室从05年开始采用Bio-Rad的ChemiDocXRS进行化学发光的检测，目前已经形成一套较为成熟的技术路线，取得大批的实验数据。本文将就Western Blotting的关键步骤及使用ChemiDocXRS的一些心得体会与大家一起分享。

二．转印过程

转印蛋白的方法有多种，最常用的是电泳转印方法，该技术具有快速、有效、并保持蛋白在凝胶中高分辨率的特性。电泳转印技术是指在凝胶中分离的蛋白质向印迹膜载体转印的过程。由于该技术可以准确、快速、高效的将蛋白转印到膜上，并可以保持蛋白在凝胶中高的分辨率，而被广泛的应用于转移印迹技术中。

常用的电泳转印系统有槽转印系统和半干转印系统，前者是将凝胶和印迹膜浸入转印缓冲液槽，然后加电压进行转印；后者是将凝胶和印迹膜放置于滤纸间形成三明治结构，而后在电极平板间进行转印。两种系统间的比较见表1.1

表1.1 电泳转印系统的比较

电泳转印过程中，凝胶和印迹膜平行放置于两极间，见图1.2。根据欧姆定律（Ohm’s）：

V=I*R，R为两极间物质的电阻值，（即转印缓冲液、凝胶、印迹膜、滤纸的电阻值），当电极两端加有电压时，就会在上述物质间产生电流，蛋白样品便发生转印。

由于两极间的电场强度（V/cm）是蛋白转移的驱动力，因此两极间的电压和距离称为凝胶上蛋白转印的关键参数。同样其他参数包括蛋白的大小、形状、所带电荷多少，电转印缓冲液的pH值、黏度、离子强度、以及凝胶密度也影响着蛋白的电转印效率。