流式细胞术在高等植物研究中的应用（一）

流式细胞术(Flow cytometry，简称FCM)是20世纪70年代发展起来的一种对细胞的物理性质及化学性质，如细胞大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等进行快速测定并可分类收集的技术。该技术超越了传统显微分析技术，能在瞬间对大量细胞进行准确的分析。这种快速有效的细胞分析技术已广泛应用于细胞生物学、免疫学、发育生物学、细胞动力学、生理学、分子生物学等生物学研究的各个领域

--，在其基础上建立的流式细胞仪系统，具有体积小、功能全和使用方便等特点。本文简要介绍FCM 的原理，对其在高等植物研究中的应用作了综述。

1流式细胞术的原理

流式细胞术是一种能够对液流中的细胞或其他微粒进行多参数快速分析和分选的技术。它的工作原理是：在一定压力下，细胞随鞘液从样品池通过喷嘴中心进入照明室，通过激光束时使激光发生散射和折射，由前向散射光(FSC，Forward scatter)和侧向散射光(ssc，Side scatter)检测器把散射光信号转换成电信号，同时细胞所携带的荧光素被激发后所发出的荧光由聚光器收集。不同颜色的荧光被双色反光镜转向不同的光电倍增管检测器，经放大后的荧光信号和散射光信号一起通过数据化处理，再输入电脑储存并据此对细胞进行分析和分选t21。流式细胞术的主要特点是：

① 测量速度快，可在1 S内测定数万个细胞；

② 同时进行多参数测量，可以对同一个细胞做有关物理特性、化学特性的多参数测量，并具有明显的统计学意义；

③ 是一门综合性的高科技方法，它综合了激光技术、计算机技术、流体力学、细胞化学、图像技术等领域的知识和成果；

④ 既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。

总之，流式细胞术主要包括了样品的液流技术、细胞的分选和计数技术，以及数据的采集和分析技术等。

2.细胞的参量和荧光探针

FCM 是通过测量细胞的多种参量来获取信息的，细胞参数分为结构参量和功能参量两大类。结构参量主要用于描述细胞的化学组分和形态特征，例如DNA、RNA的含量，总蛋白含量、胞内PH值和细胞大小等；功能参量主要是描述细胞整体的理化和生物特性，如：细胞周期动力学、特殊配体的鉴定、特殊细胞的生物活性等，这些参量有的需要经荧光标记才能被测定，有的并不需要荧光标记[4]。

2．1参数测量的原理

流式细胞计进行多参数测量时，信息主要来自特异性荧光信号及非荧光散射信号。测量是在测量区进行，所谓测量区就是照射激光束与喷出喷孔的液流束的垂直相交点。当液流中央的单个细胞通过测量区时，受到激光照射会向立体角为2"tr的整个空间散射光线， 散射光的波长和入射光的波长相同。散射光的强度及其空间分布与细胞的大小、形态、质膜和细胞内部结构密切相关，未遭受任何损坏的细胞对光线都具有特征性的散射，因此可利用不同的散射光信号对未经染色的活细胞进行分析和分选。经过固定和染色处理的细胞由于其光学性质的改变，散射光信号不同于活细胞。散射光不仅与作为散射中心的细胞参数相关，还跟散射角及收集散射光线的立体角等非生物因素有关。

2．2细胞参数的测定

2．2．1 DNA和RNA含量

对DNA和RNA的测定及其含量的分析可以用多种荧光探针标记后测出。常用的荧光探针有吖啶橙(AO，Acridine—orange)、派洛宁Y(PY，I~yronineY)、HO(Hoechst)系列和色霉素A (CA )等。利用HO／CA 双染色还可分析DNA的碱基组成，另外还可以结合BrdU(Bromodeoxyuridine，溴脱氧尿嘧啶核苷)单克隆抗体免疫荧光来测定细胞内DNA的合成。

2．2．2蛋白质总量

用FCM 可以测定细胞中蛋白的总含量，以检测一个细胞群体生长和代谢的状态，或区别具有不同蛋白含量的细胞亚群。检测总蛋白的常用荧光探针为异硫氰酸荧光素(FITC，Huorescein isothio—cyanate)，FITC以共价键与蛋白上带正电的残基结合，经蓝光激发后发出明亮的绿色荧光。

2．2．3特殊配体

配体是与不同的细胞结构特异性结合很强的各种大分子和小分子物质，通过对特异性荧光标记配体的测定可以获得不少有关结构参量和功能参量的信息。用于这方面工作的荧光探针主要有FITC、罗丹明系列(如四甲基异硫氰酸罗丹明TRITC、异硫氰酸罗丹明X-RITC和美国德州红等)、藻胆蛋白系列等。

2．2．4生物活性

生物活性的测定主要包括两方面：① 细胞本身的死活；② 活细胞生物功能发挥的强弱。FCM用来判断细胞死活的常用荧光探针有两大类：一类是能透过活细胞膜进入细胞内而发出荧光的物质，例如二乙酸荧光素(FDA，Fluorescein diacetate)，它可被活细胞滞留而发出黄绿色荧光。若细胞有损伤则会从细胞中流失，观察不到荧光。另一类不能透过活细胞膜，但能对固定的细胞及膜破损的细胞核进行染色，例如碘化丙啶(PI，Propidium iodide)和溴化乙锭(EB，Ethidium bromide)。