如何选择合适的定量PCR仪？（一）

定量PCR仪主要由两部分组成，一个是PCR系统，一个是荧光检测系统。选择定量PCR仪的关键——由于定量PCR必需借助样本和标准品之间的对比来实现定量的，对于定量PCR系统来说，重要的参数除了传统PCR的温控精确性、升降温速度等等，更重要的还在于样品孔之间的均一性，以避免微小的差别被指数级放大。至于荧光检测系统，多色多通道检测是当今的主流趋势——仪器的激发通道越多，仪器适用的荧光素种类越多，仪器适用范围就越宽；多通道指可同时检测一个样品中的多种荧光，仪器就可以同时检测单管内多模版或者内标+样品，通道越多，仪器适用范围越宽、性能就更强大。荧光检测系统主要包括激发光源和检测器。激发光源有卤钨灯光源、氩离子激光器、发光二极管LED光源，前者可配多色滤光镜实现不同激发波长，而单色发光二极管LED价格低、能耗少、寿命长，不过因为是单色，需要不同的LED才能更好地实现不同激发波长。监测系统有超低温CCD成像系统和PMT光电倍增管，前者可以一次对多点成像，后者灵敏度高但一次只能扫描一个样品，需要通过逐个扫描实现多样品检测，对于大量样品来说需要较长的时间。定量PCR仪需要考虑的另外一个因素是软件设计，这一点目前较新型号的仪器都有不错的配套软件可以满足常规使用。——随着定量PCR技术在临床诊断、疾病监控、药物监测、肿瘤研究等领域的越来越广泛的应用，市面上不同品牌和设计的定量PCR仪也不断推陈出新。

1. 传统的96孔板式定量PCR仪
传统的96孔板式定量PCR仪以美国应用生物系统公司(ABI)为代表。传统96孔板式定量PCR仪的优点是可容纳的样本量大而且无需特殊耗材，可以采用传统的96孔板甚至384孔板进行批量的定量反应，但是缺点也显而易见——温度均一性不佳——平板固定加热模块的PCR温度控制有边缘效应——样品槽上每个孔之间的温度存在差异——也就是所谓位置效应（可参考生物通龙虎榜：PCR仪的选择一文），因此标准曲线的反应条件应难以做到与样本完全一致，样本和样本之间的温度控制也可能存在差异，对于灵敏度极高的定量PCR来说，任何极微小的差异都会以指数级别的规模被放大，不能不说是一种缺憾。传统反应板面积大，温度控制的精确性、升降温速度也相对较慢，因而反应速度也较慢。96孔板定量PCR仪的荧光检测分析系统，由于96孔板上样品孔的位置是固定的，每个样品孔距离光源和监测器的光程各不相同，有可能对结果产生影响。检测在试管管底进行，试管底的透光性和厚薄均一性都可能对结果产生影响。MJ和Bio-Red公司的定量PCR仪也属于这一类。

ABI的7500型荧光定量PCR仪激发光源为卤钨灯光源，5色滤光镜，可同时激发96个样品，超低温CCD具备同时多点多色检测的能力，能够有效地分辨FAM/SYBR Green I, VIC/JOE, NED/ TAMRA/ Cy3, ROX/Texas Red,和Cy5等荧光染料。多色荧光检测技术为多重定量、SNP分析、基因型分型和带阳性内对照的阴/阳性分析提供了基础。多重定量即在同一反应管内同时对多个目标基因进行定量，可以大大提高精度并节约成本。随机配置的定量PCR引物和探针设计软件Primer Express非常有用，“因为到目前为止还没有其他软件有能力设计定量PCR所需的TaqMan探针”。 各型号都有实时动态(Real-Time)和终点读板(Plate Read)两种运行模式。实时动态模式用于定量DNA或RNA拷贝数。可以动态显示PCR扩增曲线的生成，定量的线性范围大于9个数量级，区分5000和10000个拷贝的DNA模板可信度达99.7%。终点读板模式用于基因型鉴定、点突变检测和单核苷酸多态性(SNP)分析等。当然，也可以作为普通PCR仪使用。ABI定量PCR仪最大的优势在于ABI已经发布十二万种Taqman Gene Expression Assays 人、大鼠、小鼠基因组基因表达分析试剂盒，覆盖人类全部4万个基因，二百万种Taqman Validated SNP Genotyping Assays 人、大鼠、小鼠基因组SNP检测试剂盒，为运用7000、7300、7500、7900型开展课题研究创造了绝佳的条件。ABI 的定量PCR仪均支持两种定量化学：TaqMan荧光探针和SYBR Green I荧光染料。其熔解曲线(Dissociation Curve)功能用于判断PCR扩增反应是否特异，有无杂带生成。7500型号比7300多一个滤光镜，新的光路设计使长波长红色荧光的检测灵敏度大大提高，带有快速运行模式。增强的7900型在96孔模块的基础上更加可以更换384孔版模块，使得高通量处理数据的能力大大增强，应该更适合经常处理大量标本的实验室。

MJ的Option系列是在MJ原来的常规PCR仪基础上改造，采用LED光源PMT光电倍增管荧光检测器。 96个单色LED光源对应96孔板，但是单色LED激发波长范围较窄。Option是单道单个光电倍增管荧光检测器，升级的Option2是双PMT光电倍增管荧光检测器，PMT灵敏度高但一次只能扫描一个样品，所以Option系列是逐孔扫描而非同时检测96个样品。双PMT可同时进行双色检测(FAM/SYBR Green I；VIC/Joe/TAMRA)。优势之一是带梯度功能。Bio-Rad(伯乐)也算是个熟悉的品牌，iCycler iQ实时定量PCR系统也是96孔平板式固定加热的，荧光检测波长范围400-700nm，可4波长同时检测，仪器的设计灵活，定性和定量部分可独立工作，同样可完成梯度PCR。5组滤光片位置使用户可以自由选择不同的检测波长。专利技术intensifier荧光放大器保证了极高的检测灵敏度。MJ被Bio-Rad收购后，Option和iCycler iQ目前还是各自走各自的销售渠道，至于将来Bio-Rad会如何决定二者的发展方向还需要拭目以待。