试剂、试剂盒 扩增缓冲液DNA 聚合酶 DNaseI限制性内切核酸酶ATP链霉亲和素-磁珠结合缓冲液T4DNA 连接酶热稳定 DNA 聚合酶琼脂糖凝胶BACDNA缺口平移缓冲液杂交液平末端 cDNACot1 基因组 DNA胞浆 poly(A)+RNAdNTP 溶液DNA 分子质量标志物寡核苷酸阳性对照 DNA标记化合物
仪器、耗材 自动加样尖头盖革计数器或切伦科夫计数器加热装置杂交炉振荡水浴 磁性分离装置微量离心管自动加样器SephadexG-50 离心柱顺磁珠热循环仪水浴
实验步骤
材料
缓冲液与溶液
10x 扩增缓冲液
缓冲液中含有 0.01%(m/V) 的明胶
ATP(10 mmol/L)
2X 杂交液
1.5mol/L NaCl
40 mmol/L 磷酸钠缓冲液（pH7.2)
10 mmol/L EDTA(pH6.0)
10xDehardt’s 液
0.2%SDS
NaOH(0.lmol/L)
1X 缺口平移缓冲液
500 mmol/LTris-HCl(pH7.5)
100 mmol/LMgCl2
50 mmol/LDTT
SDS(10%)
20XSSC
链霉亲和素-磁珠结合缓冲液
10 mmol/LTris-HCl(pH7.5)
1 mmol/LEDTA(pH8.0)
1mol/LNaCl
Tris-HCl(lmol/L,pH7.5)
酶及缓冲液
DNA 聚合酶/DNaseI(5 单位/ul;Boehringer Mannheim 公司）
限制性内切核酸酶
T4DNA 连接酶
热稳定 DNA 聚合酶
凝胶
琼脂糖凝胶（1%),0.5XTBE 配制
见步骤 18.19,24 和 25
核酸与寡核苷酸
含有靶标基因组 DNA 区域的 BACDNA
纯化方法见第 4 章方案 8 或 9。
随机引发制备的平末端 cDNA
见方案 1 阶段 1。
Cot1 基因组 DNA
胞浆 poly(A)+RNA, 纯化自研究对象组织或细胞系
见方案 1 阶段 1。
DNA 分子质量标志物
dNTP 溶液，每种 dNTP 浓度 0.4 mmol/L(pH8.0), 用于缺口平移标记实验
dNTP 溶液，每种 dNTP 浓度 2.5 mmol/L(pH8.0)，用于 PCR 扩增
寡核苷酸 [10 mmol/L,TE(pH8.0) 配制]
阳性对照 DNA
阳性对照 DNA 须是已知存在于初始基因组 DNA 中的基因或表达序列标签（EST）的一部分。如没有已知基因，则在标记之前在基因组 DNA 中（按 1:1 分于比例）加入一段单拷贝对照 DNA，闻时在 cDNA 样品中加人对照 DNA, 使对照 DNA 与 cDNA 的分子比例为 1:106。应用第 9 章给出的方案之一标记 DNA 样品；标记方案的选择取决于实验目的（关于选择的讨论，参见第 9 章的导言）。
标记化合物
[a-32P]dCTP(3000Ci/mmol)
Biotin16-dUTP(0.4 mmol)
考用设备
带滤芯的自动加样尖头
盖革计数器或切伦科夫计数器
预设溫度为 14°C 和 100°C 的加热装置
带旋转轴的杂交炉，或振荡水浴
分离链霉亲和素磁珠的磁性分离装置
微量离心管（PCR 扩增用 0.5 ml 薄壁管）
带退尖头装置的自动加样器
SephadexG-50 离心柱，用 TE(pH7.6) 平衡
Steptavidin 包被的顺磁珠
可按预设扩增方案进行的热循环仪
如热循环仪不带热盖, 则须使用矿物油或封口石蜡以减少 PCR 时反应混合物的液体蒸发，使用封口石蜡不仅可以防止蒸发，还可在反应馄合物加热之前保持组分（例如引物和模板）分离，这有助于防止在反应的初始阶段引物的非特异结合（见第 8 章信息栏"热启动 PCR")。
预设溫度为 65°C 的水浴
附加试剂
本方案步骤 1 所需的试剂列在第 10 章，方案 2。
本方案步骤 2 所需的用于随机引物起始双链 cDNA 合成或用于从 cDNA 文库中扩增插入片段的试剂列在方案 1, 阶段 1 和 2。
本方案步骤 2 标记所需的试剂列在第 9 章，方案 3、5 和 6。
本方案步骤 19 和 20 所需的试剂列在第 6 章，方案 8 和 10。
方法
带接头的 cDNA 库的制备
1. 按照第 10 章方案 2, 用多聚核苷酸激酶分别对 Ooligo3 和 oligo4 的 5'末端磷酸化进行标记，将标记的两种互补的寡核苷酸按等分子比例混合（每种约 2ug)，100°C 变性 10 min, 缓慢冷至室温。这一过程中，两种寡核苷酸复性形成衔接子。将衔接子的浓度调整为 1ug/ml。
2. 以胞浆 poly(A)RNA 为材料，利用随机引发制备至少 2ug 的平末端双链 cDNA(见方案 l)。
3. 在一个无菌的 0.5 ml 微量离心管中配置以下连接反应体系：
双链平末端 cDNA(步骤 2) 2ug
寡核苷酸扩增盒混合物 3ul
(1ug/ul，来自步骤 1)
10XT4DNA 连接酶缓冲液 3ul
10 mmol/LATP 3ul
T4DNA 连接酶 (1 单位/ul) 3ul
加 H2O 至 30ul
14°C 温育 16 h。在 65°C 放置 10 min 灭活 T4DNA 连接酶。
10x 连接反应缓冲液组分已添加 ATP, 则反应混合物中可加入更大体积的载体或外源 DNA。使用商品化的含 ATP 的连接缓冲液，则无须添加 ATP。
4. 用酚: 氯仿抽提连接反应产物，结合 SephadexG-50 离心柱层析对产物进行纯化并用常规的乙醇法沉淀 DNA。沉淀干燥后重溶于 10ulTE(pH7.6)。
基因组 DNA 克隆的生物素标记
5. 利用缺口平移法在 BAC 基因组 DNA 克隆中引入生物素化的碱基。在一个无菌的 0.5 ml 微量离心管中配置以下缺口平移反应体系（对每个 BAC 基因组 DNA 分别标记):
纯化的 BAC DNA(0.1 mg/ml) 1ul
生物素-16-dUTP(0.04 mmol/L) 1ul
10x 缺口平移缓冲液 2ul
用于缺口平移的 dNTP 溶液（0.4 mmol/L) 1ul
[a-32P]dCTP(3000Ci/mmol) 1ul
DNA 聚合酶/DNaseI(5 单位/ul) 1ul
加 H2O 至 20ul
4°C 反应 2 h。
6. 对用缺口平移法进行放射性与生物素标记的产物用 Sephadex G-50 离心柱层析进行纯化，并用常规的乙醇法沉淀 DNA。沉淀重溶于 10ulTE 并-20°C 保存。
链霉亲和素磁珠的制备
7. 在一个无菌的 1.5 ml 小离心管中，用 500ul 链霉亲和素-磁珠结合缓冲液洗涤 3 mg(300ul) 磁珠三次。每次洗涤后用磁性分离装置将磁珠从结合缓冲液中取出。洗涤后磁珠重悬于链霉亲和素-磁珠结合缓冲液，浓度为 10 mg/ml。
8. 对每一标记反应都取少量产物（步骤 6) 检测其结合链霉亲和素包被的磁珠的能力。
在一个无菌的 0.5 ml 微量离心管中配置以下结合反应体系
洗涤后的链霉亲和素包被的磁珠（步骤 7) 20ul
标记的基因组 DNA 连续片段*（步骤 6) 1ul
链霉亲和素-磁珠结合缓冲液 29ul
*将叠连群上分别标记的每个 BAC DNA 等量混合，混合物浓度为10ng/ul。
室温温育 15 min, 中间不时温和混匀。用磁性分离装置分离磁珠，转移上清至一个无菌的 0.5 ml 微量离心管中。用盖革计数器或切伦科夫计数器检测磁珠和上清中的放射性活度。如结合的同位素与游离的同位素比例大于 8:1, 则进行直接筛选。
如结合的同位素与游离的同位素比例小于 8∶1, 可能表明步骤 5 中的 DNA 不适合标记。可在进行标记前, 对 BACDNA 再次用酚: 氯仿反复抽提并通过 SephadexG-50 离心柱层析纯化。
直接筛选（第一轮筛选）
9. 按以下步骤用 C0tlDNA 封闭或 “重复抑制” cDNA 库（来自步骤 4) 中的重复序列：
a. 在一个无菌的 0.5 ml 微量离心管中配置以下复性反应体系：
带接头的 cDNA(步骤 4) 5ul(1ug）
人基因组 C0tlDNA 5ul(1ug）
b. 在反应混合物上方加入低比重矿物油（约 50ul) 防止蒸发，然后 100°C 变性 10 min。冷却反应体系至 65°C, 向矿物池下加入 10ul 的 2X 杂交液。海和混匀后 65°C 温育 4 h。
如使用的为 YAC 基因组 DNA 靶标，则 DNA 可能为宿主（酵母）核糖体序列所污染。至少用 100ng 来源于 rRNA 的 cDNA 封闭这些序列（见本方案结尾疑难解答)。
10. 当 cDNA 库与 C0tlDNA 的杂交完成后，进行第一轮直接筛选。取 5ul(50ng) 来自步骤 6 中生物素标记的 BAC DNA 加在一个新的 0.5 ml 量微量离心管中，在反应液的上方覆盖一滴矿物油（约 50ul) 防止蒸发。100°C 变性 BAC DNA10 min 后，冷却反应体系至 65°C。
11. 在无菌的 0.5 ml 微量离心管中配置以下复性反应体系：
生物素际记的 BAC DNA(来自步骤 10) 5ul(50ng)
封闭后的 cDNA(来自步骤 9,1ug 20ul
cDNA 加 1ug C0tlDNA)
2x 杂交液 5ul
温和混勻，旋转杂交炉或振荡水裕 65°C 温育 54 h 以上。
12. 为进行基因组 DNA 与 cDNA 杂合体的捕获与洗涤，在无菌的 1.5 ml 微量离心管中加入以下试剂：
洗涤后的链霉亲和素包被的磁珠 100ul
复性反应混合物（来自步骤 11) 30ul
链霉亲和素-磁珠结合缓冲液 100ul
室温温育 15 min, 中间偶尔温和混匀。用磁性分离装置吸附磁珠，然后移除上淸。
用 1 ml1xSSC/0.1%SDS 在室温洗涤磁珠两次，每次 15 min; 然后用 1 ml 0.1xSSC/0.1%SDS 在 65°C 洗涤磁珠三次，每次 15 min。最后一次洗涤后，将磁珠转移至一新的微量离心管中。
13. 将步骤 12 中杂交在磁珠上的 cDNA 洗脱下来：
a. 加入 100ul 的 0.1mol/LNaOH, 室温放置 10 min。
b. 加入 100 的 1ml/L Tris-HCl(pH7.5)
c. 将反应混合物通过 Sephadex G-50 离心柱层析进行脱盐（见附录 8)
第一轮筛选得到的 cDNA 的扩增
14. 从洗脱下来的 200ul 的 cDNA(步骤 13) 中取三份（1ul、5ul 和 10ul) 分别加入无菌的 0.5 mlPCR 管中。
15. 在每管中各加入以下试剂：
引物 oligo3(10 mmol/L) 5ul
10XPCR 缓冲液 2.5ul
dNTP 溶液（每种 2.5 mmol/L)，PCR 用 2.5ul
Taq DNA 聚合酶（Perkin Elmer 公司，5 单位 ul) 0.2ul
加水至 25ul
按上述配置同时设置两个对照实验。阴性对照管加入上述所有试剂，但省略 cDNA 模板。第二个对照中则加入 10ng 初始 cDNA(步骤 4) 作为模板。
16. 如热循环仪不带热盖，则在反应混合物上方覆盖一滴（约 50ul) 低比重矿物油以防止蒸发。或者加入石蜡珠以应用热启动 PCR。将 PCR 管置于热循环仪上。
17. 按下表列出的变性、复性和延伸参数进行扩增反应。
18. 用 1% 琼脂糖凝胶在 0.5XTBE 电泳缓冲液中电泳分析每管中 10% 的 PCR 产物，加入适当大小的 DNA 分子质量标准。用溴化乙啶或 SYBR GOLD 染胶以显示 DNA, 估计 cDNA 扩增产物的浓度，确定能产生最大置扩增产物应加入的模板 cDNA 浓度。
成功反应的产物可见弥散的 cDNA 扩增片段, 可能带有一些清晰的条带。
19. 从每管中取等量扩增产物（每泳道约 0.5ug) 加在第 2 块 1% 琼脂糖凝胶上，同样加入适当大小的 DNA 分子质量标准。同时上样 0.5 步骤 4 中随机引发所制备的 cDNA。
20. 将分离开的 DNA 转移到膜上，通过 Southrn 印迹（第 6 章方案 8) 与放射性标记的阳性对照 cDNA 杂交。
筛选得到的 cDNA 产生的杂交信号应比随机引发制备的 cDNA(步骤 4) 产生的杂交信号约强 1000 倍以上。
21.—旦阳性对照的富集得到证实，大量扩增以制备至少 1.5ug 的筛选得到的 cDNA。
用酚: 氯仿抽提反应产物，并用标准的乙醇法沉淀 DNA。沉淀干燥后重溶于 7.5ulTE 中（200ug/ml)。
cDNA 直接筛选（第二轮筛选)
按照第一轮筛选的条件进行，使用的 cDNA 是 1ug 第一轮筛选产物，基因组靶标 DNA 用量为 50ng(此例中全长为 500kb)。
22. 按步骤 9 的描述封闭第一轮所筛选 cDNA 中的重复序列（用 1ug 第一轮筛选产物并保留 0.5ug 供后续分析)。
23. 按步骤 9 至 13 进行第二轮筛选。
24. 按步骤 18 用 1% 琼脂糖凝胶电泳分析第二轮筛选扩增产物，在另一个泳道上样保留的 0.5ug 第一轮筛选 cDNA 产物，同时上样 0.5 初始 cDNA。
25. 按步骤 20 用放射性标记的报道探针进行 Southern 印迹分析。
通常此次分析结果将显示, 从初始 cDNA 到第一轮筛选 cDNA 报道探针的丰度得到极大的提髙，而从第一轮筛选 cDNA 到第二轮筛选 cDNA 报道探针的丰度将得到相对适度的提高（约 10 倍）。
26.—旦阳性对照的富集得到证实，将筛选得到克隆到合适的载体中去。扩增接头盒上带有的限制位点有利于将第二轮筛选得到的 cDNA 克隆人噬菌体或质粒载体中。
一个很有用的选择是使用一种现已商品化的不依赖连接的克隆系统（例如 Life Technologies 公司的 UDG 系统或者 CLONEAMP 公司 pAMP 载体系统)。如使用这些系统之一，则使用 5'经过廷伸修饰的 oligo3 引物 (细则参见生产厂家）。关于这一策略的深入讨论，参见信息栏「不依赖于连接的克隆」。
