RISPR标记基因位点，揭示人类细胞染色体空间组织

　　在真核细胞的细胞核中，基因组会被核小体包裹形成染色质[1]，而染色质在空间上的分布是否有一定的规律是长期以来科学家们在努力研究的问题。了解其分布规律有利于增强对于细胞核的组织结构以及一些重要细胞活动的理解[2-4]。本研究利用改良的CRISPR/Cas9系统在二倍体活细胞中对随机选中的基因组位点进行标记并通过高分辨宽场成像记录其空间位置，为细胞核内染色质的有序分布提供了有力的图像证明。

　　人类基因组DNA的长度接近两米，由挤在一个细胞核中的46条染色体组成，这个细胞核直径长达10-20微米之间，带着染色体进行一系列的细胞过程。在这些细胞过程中，DNA会在不同程度上进行自我调节，产生很多形态学上的变化，比如折叠、压缩和打开。

　　为了实现自我调节这一目标，染色质在细胞核这样狭小的空间里需要维持一个有序的状态，但是其在空间上分布是否均匀，则属于细胞生物学的研究范畴了。

　　目前，有两种确定染色质三维空间结构的方法，荧光原位杂交技术和乳糖操纵子系统。还有一种方法，就是3D 基因组方法，这种方法引入了染色体构象俘获技术，比如Hi-C技术。本研究使用的是改良的CRISPR/dCas9系统，在sgRNA后接了两种发夹序列（MS2或者PP7），它们的结合蛋白MCP以及PCP分别用EGFP和mCherry荧光蛋白进行标记。为了得到细胞核内染色质天然的空间组织分布，研究者选择对处于细胞间期的二倍体人胚肺成纤维细胞进行标记。

　　本文由来自中国科学院生物物理研究所生物大分子国家重点实验室的张先恩及其团队发表于Elseveir期刊BBA Molecular Cell Research。为了保证标记效率，研究者选择周期大于30 bp，拷贝数大于50 的DNA位点作为靶标。研究者随机选择了分别位于3号、14号、19号以及X染色体上的四个位点，并命名为C3、C14、C19和CX，并将CRISPR/dCas9及相关标记蛋白转入细胞。将C3分别与其它三个位点配对成像，利用胸腺嘧啶核苷双封闭方法使所有细胞同步。在G1期后期，染色体不复制，等位基因位点在一对姐妹染色体上，此时出现同一颜色的两个标记物信号。当细胞进入S期，四对标记物信号在每个细胞中出现，这一现象表明染色体开始复制，并且每个标记物信号会变为两个，并定位在两个姐妹染色单体上。

　　等位基因之间的线性距离可以反应细胞核中同源染色体的相对位置。在G1期后期，等位基因上的标记物之间的距离相对稳定。然后，研究者们对S期早期等位基因之间的距离分布进行分析，结果显示其距离也是相对稳定的，并且这两个细胞时期同一对等位基因之间的线性距离没有显著性差异，这说明在测定的细胞周期中标记的每对等位基因之间的空间位置是相对稳定的。接下来，作者通过测定标记位点与细胞核边缘以及质心的距离对等位基因在细胞核中的方向和位置进行分析，结果显示G1期和S期所选的四对标记位点期距离细胞核边缘的距离服从一个正态分布，并且两个时期之间的距离没有显著性差异。

　　接下来，研究者为了分析细胞核内非同源染色体之间的空间分布，将四个处于不同染色体上的位点分为三组，分别用两种颜色的荧光蛋白对其进行标记，并测定两个荧光信号之间的直线距离。分析显示，非同源染色体上的基因位点之间的距离在G1期和S期是相对稳定的，并且两个时期之间没有显著性差异。

　　总而言之，通过CRISPR/dCas9基因标记方法，研究者实现了对于二倍体活细胞中的三对基因位点在细胞间期（G1期后期和S期早期）空间位置关系的记录。

　　其研究结果显示标记位点所在的非同源染色体之间的距离是相对稳定的，这说明细胞核中染色质的空间结构并不是随机和无序的，这为细胞间期染色质在空间中的有序分布提供了更多的证据，而这种稳定性对于细胞实现复杂的生命过程也是十分重要的。