3.3 文库的克隆和回收
( 1 ) 插入片段和载体的理想比例是（2 : 1 ) ~（3 : 1 )。我们将用于连接的 DNA 浓度限制在 10 ng/μl，使用 1 mmol/L 的 ATP，16°C 连接过夜（见注 8 )。
( 2 ) 连接反应体系于 65°C 处理，使酶失活，用氯仿抽提，然后用乙醇沉淀，得到的 DNA 放置几分钟风干，最后用 30 μl 去离子水重悬。
( 3 ) 同一天还要制作 SS 320 大肠杆菌细胞株（见注 9 ) 的电转感受态（见 15.3.8)。第（2 ) 步得到的连接产物与 300 μl SS320 细胞混合，加入至槽宽 2 mm 的电转杯，使用 GenepulserTMII 进行电转化。将仪器参数设定如下：2.5 kV，25 μF，200~400Ω。为了得到最好的结果，时间常数对应 200Ω 时应设为 3.8~4.5，400Ω 时应设为 7.6~9.0。脉冲后立即加入 1 ml 预冷的 SOC 培养基。将细胞转移至 15 ml 锥形管，用 SOC 培养基洗涤电转杯 2 次，最大限度地回收电转细胞，细胞在 37°C 适当转速下干 5 ml SOC 培养基中复苏 30 min。
( 4 ) 取适量电转细胞，稀释 104 倍，涂平板，菌落计数，用以衡量连接和克隆的效率（见注 10)。剩余细胞加入至 250 ml 的含合适添加剂的 LB 培养基中 [ 见 15.2.2 ( 9 ) ] 培养用于提取 DNA。
( 5 ) 使用 Qiagen Midiprep Kit 或其他类似碱裂解试剂盒提取 DNA [47] 。
3.4 文库筛选
( 1 ) 使用槽宽 1 mm 的电转杯，将 15.3.3(5) 得到的文库 100 ng 电转化到 65 μl 已经携带有质粒 pQE-32 ras-F [3] 的 BL21 pREP4 细胞中。仪器参数：1.25~1.6 kV，25 μF，200 Ω。时间参数对应于 GenepulserTM II 时设为 3.7~4.2，对应于 Electroporator 2510 时设为 4.0~4.6。细胞在 37°C SOC 培养基中复苏 30 min。
( 2 ) 用 PBS 洗细胞 2 次以除去 SOC 培养基。
( 3 ) 将细胞涂布于 15.2.3 ( 6 ) 所述的选择性平板，30°C 培养 24~72 h ( 见注 12)。同时，另取出部分电转细胞，稀释 103 倍涂平板，用于计数和与阳性对照比较，估算转化效率和文库克隆的细胞存活率。例如，我们同时转化相同量的表达野生型 RBD 与 F [ 1，2 ] 融合蛋白的载体，将电转细胞稀释 104~105 倍涂平板。在每一步的操作中，所有的测量都要避免文库与野生型正对照的交叉污染。
3.5 克隆竞争实验
改编自参考文献 [32]。
( 1 ) 经过适当时间的培养，用少量的选择培养基回收 15.3.4 ( 3 ) 平板中的细胞，加入到 25 ml 选择培养基中，30°C 250 r/min 培养。
( 2 ) 培养 24 h 后，取 1 μl 饱和培养物稀释至 2 ml 新鲜选择培养基中。
( 3 ) 可以重复第 ( 2 ) 步直至文库达到目标丰度。正常情况下，12 代（12 D ) 后，文库在很大程度上得以浓缩。但是，这对于不同的系统是不同的，受到各种因素的影响，如文库的简并性和严密性突变体的使用（见 15.3.1.2)。
( 4 ) 在任何一步，都可以将饱和培养物稀释 104~105 倍涂于选择性平板上，以定性检测竞争效率。随着连续竞争的进行，菌落间的大小差异将逐步减小，菌落的平均大小将增加。
( 5 ) 在任何一代，都可以取出 10 μl 文库加入 2 ml LB ( 100 μg/ml 氨苄青霉素，25 μg/ml 卡那霉素）培养过夜，然后使用 QIAprep 提取文库中的克隆的 DNA ( 见注 14)。
3.6 克隆的分离与测序
以下步骤既适用于提取文库中所含的独立克隆的质粒，也适用于上述操作中质粒混合物的提取。
( 1 ) 从克隆库中取出 300 ng DNA，加入限制性内切核酸酶消化，所用限制性内切核酸酶位点在 pREP4 和 pQE-32 ras-F[ 3 ] 质粒中存在，但在文库载体中不存在。基于此目的，我们使用 Xmal、EcoNI 和 Xba l ( 见注 15)。
( 2 ) 取 1/10 的酶切产物，转化 XL- 1 Blue 感受态细胞，取 20 μl 涂布含 100 μg/ml 氨苄青霉素的 LB 平板（见注 15)。
( 3 ) 挑菌落于含 100 μg/ml 氨苄青霉素的 LB 中培养。
( 4 ) 提取高质量的 DNA 用于测序。若操作 96 个样品，使用 MontageTMkit；样品数量少，适用 QIAprep column kit。
( 5 ) 我们使用只能和文库质粒退火（如 F [ 1，2 ] 内部序列）的引物进行测序（见注16 )。
( 6 ) 测序。
3.7 蛋白质提纯及其性质检测
分析测序结果，选择感兴趣的克隆排列在 96 孔板的合适位置。此时，克隆可以转化 XL-1 Blue 细胞，冻存作为备份。
( 1 ) 选中的克隆重新构建，只与 6X His tag 融合并表达蛋白质（见注 17)。诱导检测 6X His 克隆的表达（见注 18)。
( 2 ) 提取正确表达的克隆的质粒。
( 3 ) 转化 BL21 pREP4 细胞，涂布含 100 μg/ml 氨苄青霉素和 25 μg/ml 卡那霉素的平板，37°C 培养过夜。若平行操作多个克隆，可以使用 24 孔板。本例中，每个转化所用感受态细胞不要超过 20 μl，每平板最多也只涂 20 μl。涂板若超过最大允许体积，细胞将不能完全被培养基吸收。
( 4 ) 次日，挑菌落于 2.5 ml 含合适抗生素的 LB 中 37°C 培养过夜（见注 19)。
( 5 ) 以 1 :10 的比例将饱和培养物加入 25 ml 含合适抗生素的 TB 培养基中（见注 20)。
( 6 ) 加入 IPTG 至终浓度为 1 mmol/L，37°C 培养 90~120 min，收获细胞直接提取蛋白质或 -80°C 保存（见注 21)。
( 7 ) 细胞用 1 ml Buffer A [ 见 15.2.6 ( 8 ) ] 重悬，然后重新排列在 96 孔板中（见注 22）。3200 g 离心 40 min，去除大部分不可溶组分。
( 8 ) 0.2 μm 96 孔 PVDF 板中含有 200 μl 50% 的 Ni-NTA Superflow 树脂。将体积扩增器安装于 0.25 mm 的 96 孔玻命纤维过滤板上方，再将此装置安装在真空歧管的密封块上（见注 23)。然后，在第一个过滤板中加入 900 μl 样品，再加入 100 μl 乙醇以减小交叉感染的风险。用大约 500 mbar 的压力抽滤直至所有样品全部通过此板（见注 24)。
( 9 ) 现在 PVDF 板应含有树脂和样品抽提物。停止抽滤，从收集器上取下 PVDF 板，安装在真空歧管的密封块上，然后用大约 100 mbar 的压力抽滤直至所有样品全部通过树脂（见注 25)。
( 10 ) 用 800 μl Buffer B 洗 2 次 [ 见 15.2.6 (9) ]，每次真空压力设为 500 mbar ( 见注 26)。
( 11 ) 放置好收集器，在 100 mbar 的压力下用 100 μl Buffer E 洗脱样品 4 次 [ 见 15.2.6 ( 10 ) 和注 26]。加入 1 mmol/L DTT 并将 pH 调至 5 ( 见注 27)。至此，样品可以直接用于性质检测（见注 28)。
3.8 制备 SS 320 和 BL21 pREP4 pQE-32 ras-F [ 3 ] 感受态细胞
按参考文献 [ 48 ] 方法准备细胞。
( 1 ) 挑 SS320 或 BL21 pREP4 pQE-32 ras-F 单克隆于 5 ml LB 或 5 ml SOB 培养基中，37°C 培养 5 h 到过夜。
( 2 ) 取 2.5 ml 培养物加入至 500 ml LB 或 500 ml SOB 培养基中，37°C 300 r/min 培养到 OD600 为 0.5~0.7。
( 3 ) 冰浴 10~15 min 然后转移至预冷的 1 L 离心瓶中。
( 4 ) 5000 g 离心 20 min。
( 5 ) 弃上清液，用 5 ml 冰水重悬菌体，加入 500 ml 冰水混匀，离心同第（4 ) 步。
( 6 ) 立即弃上清液，用剩余液体重悬菌体。
( 7 ) 再加入 500 ml 冰水混匀，离心同第（4 ) 步。
( 8 ) 立即弃上清液，用剩余液体重悬菌体。
( 9 ) 若细胞用于电转化，将重悬细胞转移至预冷的 50 ml 离心管，2°C 5000 g 离心 10 min。估算菌体体积（一般 500 ml 培养物会得到 500 μl )，在冰上加入相同体积的预冷水重悬细胞。Aliquot 50~300 μl 细胞至预冷的离心管中，细胞密度大约是 2X 1011 个细胞/ml。
( 10 ) 若要冻存电转化细胞，在第（8 ) 步得到的细胞中加入 40 ml 预冷的 10% 甘油并混匀。离心细胞同第（9 ) 步，估算菌体体积，在冰上加入相同体积的预冷 10% 甘油重悬细胞。Aliquot 50~300 μl 细胞至预冷的离心管中用干冰冷冻，-80°C 储存。
3.9 制备 XL-1 Blue 和 BL21 pREP4 感受态细胞
按照参考文献 [ 49 ] 方法准备细胞，稍作改动如下：细胞在第一次离心后仅洗 1 次，4°C 倒置离心瓶于纸上，除去痕量的培养基（见注 29)。
( 1 ) 在 200 ml SOB 或 LB 培养基中加入过夜培养物，18℃（200~250 r/min）培养至 OD600 约 0.6。
( 2 ) 冰浴 10 min 并转移至 500 ml 离心瓶。
( 3 ) 4°C 2500 g 离心 1 min。
( 4 ) 用 80 ml 预冷转化缓冲液重悬菌体，并冰浴 10 min，离心同（3 )。
( 5 ) 用 20 ml 预冷转化缓冲液轻柔的重悬，加入 DMSO 至终浓度为 7%。
( 6 ) 冰浴 10 min。
( 7 ) Aliquot 细胞重悬物，液氮冷冻。
