31. 乙醇沉淀：
11.5 ml 样品
10 ul SeeDNA
100 ul 糖原
5.1 ml 7.5 mol/L 乙酸铵
38.3 ml 100％ 乙醇
干冰/甲醇浴 15 min。然后室温溶化 2 min。
32. 轻轻涡旋混匀，台式离心机的吊桶转子室温约 3000 g （4000 r/min） 离心 30 min。
33. 用 5 ml 70％ 的乙醇祸旋，洗漆，吊桶转子约 3000 g 室温离心 5 min。
34. 沉淀重悬于 216 ul LoTE 缓冲液。加入 54 ul 5× 上样缓冲液（终体积 270 ul）。
35. 3 个 20％ 聚丙烯酰胺/TBE 凝胶，每孔上样 10 ul。在 27 个泳道用加长的吸头上样，每个加 10 ul （不要过载）。每块凝胶加 10 ul 20 bp 序列阶梯作分子质量参照物。
36. 160 V 电泳 90 min 到距凝胶底约 1 cm，使 103 bp 的双标签片段和 80 bp 的连接子-连接子二者尽可能分开。
37. 在一个用锡箔包好的容器里染凝胶，50 ml TBE 缓冲液中加入 2～5 ul SYBR Green I。让凝胶在水平摇床上浸泡 15 min， 在用 SYBR Green I 或 UV 滤镜的 UV 盒上 观察。
38. 从凝胶上只割出扩增的带双标签的产物，把 3 个割出的凝胶放在硅烷化的 0.5 ml 离心管里（总共 9 个 0.5 ml 的管子），这些管子的底部都有一个直径约 0.5 mm 的 小孔（用 21-G 针头刺的）。
39. 把 0.5 ml 的离心管放在 2.0 ml 的硅烷化的离心管里，最高速离心 4 min （这样可以使聚丙烯酰胺凝胶打碎成小块，收集在 2.0 ml 的管底）。
40. 扔掉 0.5 ml 的离心管。每个 2.0 ml 离心管中加入 250 ul LoTE 缓冲液和 50 ul 7.5 mol/L 的乙酸铵。
41. 涡旋每个管子，然后置 65°C 15 min。在 18 个 Spin-X 离心管的滤膜上各加 5 ul LoTE 缓冲液。
42. 把每个管里的溶液转移到 2 个 Spin-X 的离心管滤膜上（即 9 管转移到 18 个 Spin-X 的离心管滤膜上）。最高速离心 5 min。合并两份洗脱液（总共 300 ul），转移到 1.5 ml 的微量离心管里。有时，纯化的 102 bp 的条带不能被 NlaIII 重新切开，这可能和纯化得不干净有关。如果出现这种问题，把 300 ul 洗脱液通过 Qiaquick 凝胶抽提方案抽提一次，终体积调回到 300 ul。
43. 洗脱液进行乙醇沉淀：
300 ul 样品
0.5 ul SeeDNA
1.5 ul 糖原
133 ul 7.5 mol/L 乙酸铵
1000 ul100％ 乙醇
涡旋，置于干冰/甲醇浴 15 min。室温 2 min 使融化，然后 4°C 离心 15 min。
44. 最高速离心 15 min。75％ 的乙醇洗两次。每管 DNA 重悬于 10 ul LoTE 缓冲液。 混合样品到一个管里（总量 90 ul）。
45. 用 NlaIII 消化 DNA：
90 ul LoTE 缓冲液中的 PCR 产物
226 ul LoTE 缓冲液
440 ul 10×NEB 缓冲液 4
4 ul 100×BSA
40 ul 10 U/ul NlaIII
37°C 温育 1 h。
46. 用等体积的 PC8 抽提。混合水相转移到 1.5 ml 微量离心管。在干冰上乙醇沉淀：
200 ul 样品
66 ul 7.5 mol/L 乙酸铵
3 ul SeeDNA
825 ul 100％ 乙醇
涡旋混匀，置于干冰/甲醇浴 15 min。
47. 室温 2 min 使融化，然后 4°C 离心 15 min。
48. 冷的 75％ 乙醇洗一次，用细头的吸头吸掉残余的乙醇。重悬沉淀于 40 ul LoTE 缓冲液。在冰上加入 5× 上样缓冲液（总共 50 ul）。
49. 把样品加到一个 20％ 聚丙烯酰胺凝胶的 4 个泳道中，隔开一个泳道加上 20 bp 序列阶梯作为分子质量参照物，160 V 电泳 2.5 h。用 1：10 000 的 SYBR Green I 染 15 min。
50. 在长波 UV 照射下切出 24～26 bp 的条带，每两个条带放到一个底部有约 0.5 mm 小洞的 0.5 ml 的微量离心管中（用 21-G 针头刺的）。
51. 把管子放在 2.0 ml 的硅烷化的离心管里，最高速离心 2 min。
52. 扔掉 0.5 ml 的离心管。每个 2.0 ml 离心管中加入 250 ul LoTE 缓冲液和 50 ul 7.5 mol/L 的乙酸铵。涡旋每个管子，然后置于 37°C15 min。不要在 65°C 温育。这会使得 26 bp 片段变性。可以温育更长一点的时间（甚至过夜），但看起来并不会显著提高产量。
53. 用 Spin-X 离心管滤膜按步骤 42 方法分离洗脱液。分在 3 个管里（每个 200 ul ） 进行乙醇沉淀：
200 ul 样品
66 ul 7.5 mol/L 乙酸钱
2 ul SeeDNA
3 ul 糖原
825 ul 100％ 乙醇
置于干冰/甲醇浴 10 min， 然后 4°C 离心 15 min。
54. 用冷的 75％ 乙醇洗两次。每个 DNA 样品重悬于 2.5 ul 冷的 LoTE 缓冲液（总共 7.5 ul）。在加入连接缓冲液前使纯化的双标签片段保持在冰上很重要。高 AT 含量的小片段即使在 LoTE 缓冲液中，室温下也会变性。
55. 混合下面的试剂：
7 ul 混合的双标签 DNA
2 ul 5×连接缓冲液
1ul 5 U/ul高浓度 T4 DNA 连接酶
16°C 温育 1～3 h。
不要连接过夜，因为这样会使得串联产物很长而难于克隆。
56. 连接完成后，加入 2.5 ul 5×上样缓冲液。65°C 加热样品 5 min，立刻置于冰上。
57. 在 10％～12％ 的聚丙烯酰胺/TBE 凝胶上分离串联体。在第一个泳道里加上 1 kb 的分子质量参照物，隔一个泳道把串联的样品全部加到第 3 个孔里。200 V 电泳 45 min。
