一．用户需要自备的材料和仪器
Biotnt First Strand cDNA Synthesis Kit：A2010B0B03 ；
Biotnt qPCR Premix Kit： A2010A0112；
RNA 抽提：推荐使用Qiagen RNeasy Mini Kit (50) 74104，RNase-Free DNase Set (50)，79254
DNase/RNase free枪头，PCR反应管，1.5 mL离心管
10 μL到1,000 μL可调节单通道微量移液器以及适配的枪头
5 μL到20 μL可调节多通道微量移液器以及适配的一次性枪头
定量qPCR仪器
384 微孔板排列（24*16）：每块板分为四个区，不同区内可以加入不同的样本；
二．实验步骤：
2.1 实验前准备
注意事项：
1. 开始实验前请仔细阅读产品使用手册。注意：请确认qPCR array 与您的qPCR仪器匹配；
2. 严格按照QPCR标准步骤操作，采用以上推荐试剂盒进行抽提mRNA，注意去除基因组污染；避免核酸污染和非特异性扩增。
RNA 定量与质量控制
A. 使用无菌水(RNase-free)稀释 RNA 样本，检测 260 nm 和 280 nm 吸光值，A260/280 应大于 1.8。
B. 使用公式A260× 40 ×稀释倍数 = XXXXμg/mL 计算 RNA 浓度。
C. 使用琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 完整性。
D. 建议：RNA 质量测定后，逆转录得到CDNA，建议用多个内参基因自行验证CDNA 质量；
3. 基因组DNA污染控制
每个Array板块上的GDC(Genomic DNA Control)反应孔专为检测每个样品进行qPCR反应时可能存在的基因组DNA污染而设置。如果该反应孔的CT值小于35，则表明存在可检测到的基因组DNA污染，应采取措施予以解决。因此，必须从RNA样品中去除基因组和其他全部残余污染物。建议采用Qiagen 柱式抽提过程中加入DNAse去除基因组污染。
4. RNA 含量调平：实验样本的RNA 尽量调到同一水平；加入RNA 酶free的水，调整RNA 浓度；
预计每个样本需要的 RNA 量和RT-PCR反应数(逆转录CDNA；采用逆转录试剂盒进行，每个样本准备100ul的CDNA)；
2.2 PCR-Array 实验步骤：
1． 从-20度冰箱拿出PCR Array，平衡到室温后拆开自封袋，取出PCR Array的384板；
2． 融解并充分混匀BioTNT QPCR 染料法premix，短暂离心使管中试剂处于底部，冰上保存。（一块384板需要使用4.4 ml premix）；
3． 去除积存在封闭反应板表面的冷凝物。小心撕去板上的密封膜。
4． 样本加样，进行QPCR 实验；配制过程在冰上操作。
qPCR array 可对同一样本中多个基因同时进行检测，为了充分满足实验需要以及避免实验操作产生的损耗，在配制qPCR反应液时需要比实际体积多出 10%。
充分混匀qPCR反应液，短暂离心。每个反应孔精确加入 20 μl 反应液。每次加样都需要换用新的枪头以避免交叉污染。
准备PCR 混合物：样本1准备100ul CDNA，加入1ml PCR 水和1ml premix（采用BioTNT premix，货号：A2010A0112），混合。
区一有96孔，样本一的混合物每孔加入混合物20ul；
同理，样本2的混合物加入区二的96孔中，每孔加入混合物20ul；
同理，样本3的混合物加入区二的96孔中，每孔加入混合物20ul；
同理，样本4的混合物加入区二的96孔中，每孔加入混合物20ul；
5． 使用产品包装中的新密封膜覆盖qPCR反应板，确保密封膜粘贴平整和紧密以防止光线折射和蒸发损耗。把384板放入板式离心机，2000rpm 离心2分钟；去除气泡。
6． 开始qPCR反应，推荐使用下表中两步法qPCR反应程序。当使用SYBR Green 染料监测qPCR反应时，需要在qPCR循环结束后立即进行溶解曲线分析。
【扩增条件】
以ABI 7900，7900，ViiA7(384 well block)为例，Detector设为SYBR, QUENCHER设为NONE,
95℃ 5分钟→95℃ 5秒→60℃ 30秒（读板）→溶解曲线分析
40个循环
三、数据导出后进行分析；
3.1 数据分析
基本设置
1. 确定基线
基线是qPCR扩增前期的荧光本底信号，一般都由仪器自动设置。不同仪器类型，基线的设置也略有不同，往往在荧光信号指数扩增阶段的前几个循环处，一般将定量PCR的前15个循环信号作为荧光本底信号，如果实验数据中最低CT还小于基线的设置上限，研究人员则需要手动设置。其设置原则为：起始值设置为2或3，终止值的设置为整个反应板中扩增最强检测因子的CT值减去2或3所得的值即可，一般设置在2-10的范围内，不要超过15。
2. 设定阈值
荧光阈值的正确设置是进行数据分析的关键一步，荧光阈值的设置往往在荧光信号指数扩增的起始阶段。一般情况下，内参基因的表达水平往往高于大多数的检测基因。
3. CT值的获得
所谓CT值就是在荧光PCR扩增过程中，当扩增产物的荧光信号达到设定的阈值（Threshold）时所经过的扩增循环次数（cycle），被称为CT值。
4. 多数的定量PCR仪是以Excel的形式导出CT值。
5. 选取合适的内参基因，用ΔΔCT数据分析方法对定量PCR结果进行相对定量分析。
6. 所有CT值大于35或显示N/A，均认为没有检测到该基因的表达。计算时按照CT值为35进行计算。
3.2 质量控制：
1. 通过定量PCR仪器分析软件检查每个检测基因的扩增曲线及融解曲线，每个内参基因、目的基因PCR的融解曲线均特异性的显示单峰。
2. PTC（阳性对照）反应孔，从融解曲线上分析均呈单一锐锋，从扩增曲线上分析，CT值介于17～23之间。
3. RTC（spike-in反转录对照）反应孔，从融解曲线上分析均呈单一锐锋，从扩增曲线上分析，CT值介于17～23之间。
3. 检查GDC(基因组DNA污染)反应孔的CT值。如果GDC反应孔CT值大于35，表明样本中存
在的少量基因组DNA污染不会影响基因表达定量检测结果。
4. RTC和 PTC的三重复CT 值应比较接近，说明实验重复性好。
3.3数据分析
下载数据分析系统 (http://www.biotnt.com)进行数据分析。此数据分析系统采用ΔΔCt 法来实现 fold-change 分析或基因的表达量水平(CT值)统计学分析。
1. 在开始分析前请下载并阅读“Biotnt Array数据分析操作指南”。
2. 将CT值输入相应的数据分析模板(Sample Data.xls和 Control Data.xls)，选择合适的参照和分析参数。
注意：被选作采用ΔΔCt 法对qPCR Primer Array标准化的参数必须不受实验设计影响。
因此需采用一个或多个已经过实验确证的参数。参数的单个CT值或平均值可用于标准化实验。
3. 完成指定分析。实验重复至少3次后会得到统计数值(p值)。通过分析数据结果即可简便快捷的筛选出您感兴趣的基因，便于以后的研究。
使用限制
以下条款适用于BioTNT QPCR Array产品。产品购买者需遵守最终用户限制许可条例。本产品仅限购买者内部研究使用，不得使用于人体或诊断、治疗。未经BioTNT 事先书面同意，本产品不得转售，不得重新包装或修改后转售，不得用于生产商用产品。
质量保证
BioTNT保证产品与产品数据表中描述的规格保持一致。
若经BioTNT证实产品未达到规格要求，BioTNT 将为您替换此产品。若无法替换，BioTNT将退款给购买者。此质量保证仅适用于最初产品购买者。
BioTNT仅负责替换产品或退还实际的购买金额。对于由使用或不正确使用产品产生的损害或使用其他相关材料和试剂产生的损耗，BioTNT不承担责任。BioTNT不提供任何形式的明示的或者默示的保证，包括对适销性、适用于特定用途的默示保证。
BioTNT致力于为消费者提供高质量的研究产品。如果您对BioTNT的产品有任何问题或疑虑，请拨打电话4008801880联系。
来源：BioTNT（冠泰生物）
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