ExactivePlus：精确分子量定性和筛查定量的利器

——访赛默飞世尔科技色谱质谱市场部经理王勇为博士

　　【导语】2008年第一代Exactive问世时，赛默飞的全球研发副总Ian Jardine说：“我们自问我们还能做些什么，去全面地发挥Orbitrap技术的潜力，使在常规毒理、环境和药物研发领域的客户能更方便地获得这种技术？结论就是Exactive，它是一个真正的突破，能被应用于大量挑战性的新领域中去。”4年过去了，伴随着众多全球用户的好评，赛默飞发布了第二代台式Orbitrap——Exactive Plus，所有关键性能都得以大幅提高。昆明质谱会上，本网记者有幸采访到赛默飞色谱质谱市场部经理王勇为博士，他将为我们介绍更多关于这款产品激动人心的新性能……

赛默飞世尔科技色谱质谱市场部经理 王勇为博士（左）与赛默飞世尔科技GC/GCMS市场经理 芦苓博士（右）

Exactive Plus台式Orbitrap液质联用仪

Exactive Plus台式Orbitrap液质联用仪

　　据王经理介绍，今年5月ASMS上发布的Exactive Plus，相比前一代的Exactive有了很多改进，大大提高了筛查能力，适用于未知物精确质量定性、多残留分析、复杂基质中的高通量筛查等领域，其性能包括：

　　1）扫描速度提高了2倍，最快每秒可采集12张谱图；

　　2）分辨率提高1.4倍，最高达140,000(FWHM)；

　　3）质量范围扩展至m/z 6000，可直接用于大分子量多肽/抗体等蛋白的测定；

　　4）极性切换更快，在250ms内即可完成快速的极性切换；在35,000的高分辨率下，可在1秒钟内采集一张正谱和一张负谱。

　　5）质量准确度：<1 ppm（内标），< 3 ppm（外标）

　　6）新的S型离子光学，使灵敏度提高3倍

　　7）采用C-Trap电荷检测器（CTCD），增强了AGC的性能，进一步确保谱图质量

　　8）数据相关的全离子碎裂（Data Dependent AIF）用于快速的化合物确认

　　9）可支持DART离子源接口用于筛查应用

　　10）对于预算暂时有限的客户，未来在用户现场，方便地升级为Q-Exactive

Exactive Plus系统内部结构

　　获得这些更好的性能来自于技术上的几大改进：

　　1）采用新型S型离子光学，使灵敏度提高。

　　2）采用新型的FT信号处理算法eFT，进一步提高了分辨率。

　　3）在C-Trap后面增加一个检测器（CTCD），该检测器可持续监测C-Trap中的离子数量，可获得更高的谱图质量，更好的定量结果。

　　4）增加HCD高能碰撞选件后，具备二级质谱的数据扫描模式AIF，使Exactive Plus可完成质谱全扫描，AIF扫描，数据依赖AIF，交替的全扫描/AIF扫描等多种方式。

　　王博士告诉我们，Exactive Plus具有高达140,000的超高分辨率，其优势体现在三个方面：一是区分分子量差异的能力。当两个化合物分子量非常接近时，分辨率高才能够识别，例如当质谱分辨率达到50,000时，可以区分分子量仅仅相差0.02的化合物；二是针对生物样本、食品等复杂基质样品，高分辨质谱能够提高选择性，更彻底地排除基质干扰，因此在这里高分辨又起到了色谱分离的作用，降低了分析检测中对色谱分离的要求。三是高分辨率是实现精确质量测定的一个基本条件，如果测定一个化合物的精确质量达到1－2个ppm，加上一些化学键规则的判断，可以非常方便地获得该化合物的元素组成，从而快速直接的定性。

　　本网收录相关产品：Exactive plus台式Orbitrap质谱仪

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Exactive Plus——精确分子量测量的基本工具

　　据王经理介绍，中国已经有很多从事有机合成研究工作的客户，购置了Exactive，来帮助研究合成产物及其机理。而这些工作，以前他们需送到大型质谱中心，等待用FTICR-MS来完成测试。精确分子量测定是很多科研用户最基本的需要，Exactive Plus是这类追求精确分子量测定的用户的理想选择。

　　Exactive Plus是台式的Orbitrap，这决定了它操控非常简单。不是质谱专业或分析化学专业的研究者们，都可以操控它并获得极其“漂亮的”结果。比较起来，如果用TOF类仪器，会受到气流波动、温度变化、必须要内标等多种因素的影响，而Exactive Plus消除了这些影响，随时可以获得精确的分子量测定结果。如果用FTICR-MS，一般的实验室是无力维护的，只有送到大型测试中心去测试，时间周期长，同时这些测试中心也需要对FTICR-MS投入高额的维护费用，对操作人的水平要求很高。

　　对于精确分子量测定，新一代的Exactive Plus还扩展了分子量测定的范围到m/z 6000，这对于大分子量的聚合物、多肽、蛋白、抗体、生物药物的测定带来了极大的方便。除了配备ESI、APCI源，有些用户还选择配置了AP-MALDI源，大分子量样品的测试就变得更为简单。

Exactive Plus在高分子量下的测定：用AP-MALDI源，获得5730 Da处牛胰岛素的单电荷质谱图，达到单同位素分辨，质量准确度为1.9 ppm

安装了AP MALDI源的Exactive

 

Exactive Plus——开发筛查方法非常简单

　　在筛查领域，Exactive Plus的应用领域很多，比如：药物掺假、海关、法医、食品安全、环境等。除了具有高分辨、精确质量测定的特性，还来源于Exactive Plus采集速度很快，正负极性切换速度快，可以适应于UHPLC、DART/ID CUBE等新型离子源快速筛查分析的要求，而且开发方法特别简单。

Exactive Plus，在3.2秒内，可采集13张高分辨率的谱图，质量准确度达5 ppm，全完适应于UHPLC的采集速度要求

　　关于筛查如何进行，以前本网曾有过报道：“用Q-Exactive筛查未知非法添加剂 三聚氰胺事件不再重演”，不需要做MS/MS，只需要把所有要监测的目标物的母离子精确质量，正/负离子化极性，输入列表（inclusion list），然后让Exactive/Exavtive Plus工作在全扫描状态，来监测这些目标物即可，定量时可直接应用其高分辨一级质谱HRMS来定量。比如，用Exactive结合UHPLC，可在12分钟内快速筛查510种ppb级的农残（http://www.antpedia.com/corp/data-1170.html），并可获得所有化合物良好的线性，其检测下限满足所有欧盟和日本的农残标准。举的这个筛查510种农残的例子，并不是用Q-Exactive，而是用Exactive来完成的。在上文中也谈到，使用Q-Exactive，可以在监测到母离子时，自动做MS/MS，从而满足欧盟确认化合物的点数，达到对化合物的确认。从筛查角度来讲，用Exactive即可很方便地完成筛查任务，不必考虑碰撞能量，不必调节很多参数，只需要把目标离子（或怀疑的目标离子）精确质量和极性输入列表，运行一个全扫描就可以了。方法开发的简便性、检测的高通量、快速切换正负极性、直接用HRMS筛查和定量，使Exactive Plus非常适于做筛查工具。据王经理介绍，Exactive/Exactive Plus应用于筛查和定量已有多种应用，比如：食品安全中的农兽药残留、霉菌毒素和非法添加剂、环境污染物、兴奋剂筛查、毒品和违禁药物筛查、术后病人体内免疫抑制剂的快速筛查和定量等领域。

用Exactive快速筛查510种农残的列表（部分）

用Exactive定量尿中14种benzodiazepines苯并二氮卓类镇静药物

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Exactive Plus——筛查时同时做定性

　　即使现有的法规认为，确认还需要满足欧盟点数的要求，但Exactive Plus的用户完全可以用自己的方法来作化合物的定性。这其中包括：1）目标物的定性；2）一般未知物筛查（GUS）。

　　目标物定性时，Exactive Plus监测的参数包括如下几项：目标物保留时间，同位素模式匹配，碎片检索，数据库检索，其中碎片信息以及碎片谱图都可以通过ExactFinder软件进行数据库检索。

　　对于一般未知物筛查（GUS）而言，在目标物筛查后，可以自动对所有剩余的色谱峰进行GUS筛查，包括数据库检索，建立在同位素模式匹配基础上的元素组成测定，谱图检索和internet检索。前几种检索可通过ExactFinder进行，internet检索可以通过在线的ChemSpider搜索引擎检索。

QuEChERS方法提取的马饲料样品中的85种农药残留，用UHPLC-Exactive Plus分析的定性结果。采用ExactFinder软件进行85种目标物的定性。液相时间：5分钟，Exactive™ Plus采用FS/ddAIF方式，全扫描分辨率：70,000，AIF分辨率：35,000

目标物定性后，对所有出现的剩余的峰进行GUS检索，用同位素模式匹配到的Pencycuron戊菌隆，绿色框标记的是处于基质信号中的单同位素峰，Exactive Plus的高分辨能力确保区分单同位素信号峰和基质干扰峰

更多信息见：Increasing Speed of UHPLC-MS Analysis Using Single-stage Orbitrap Mass Spectrometer

　　在同UHPLC联用进行高通量分析时，王经理还特别介绍了Exactive Plus新增加的数据依赖的AIF（ddAIF）功能：在与UHPLC联用进行高通量时，色谱洗脱时间非常短，为了提高化合物的确认能力，最好利用HCD获得分析物的碎片谱（AIF），但是在全扫描和AIF之间进行永久地切换会大幅降低采集速度，这时常需要去降低分辨率的设置。在新的Exactive Plus中增加了数据依赖的AIF（ddAIF）功能，在全扫描/数据依赖AIF（FS/ddAIF）模式下采集时，加入一个质量包括列表（列出目标物的质量），一旦检测到该目标物质量超过设置的强度阈值，只触发一次AIF扫描，这样可以使采集速度基本保持在全扫描的速度下，更加匹配UHPLC的应用要求。大家知道，Exactive Plus的检测原理是测定感应的电流信号，不需要做多张谱图的平均，只需一张谱图，就可得到高质量的信号。

在Exactive Plus上应用FS/ddAIF切换扫描模式，FS分辨率设置为70,000，ddAIF分辨率设置为35,000，只采集一张ddAIF谱图

 

Exactive Plus——连接新型离子源的应用

　　新型离子源的应用近来很热，美国FDA等法规部门已经采用DART连接Exactive来筛查几百种农药（http://www.antpedia.com/corp/data-642.html），在最新的ID-CUBE应用中，用户可更方便地将样品点在Open-Spot样品卡片上，插在ID-CUBE源上快速检测。

ID-CUBE源和Exactive联用

将溶解后的样品点在OpenSpot卡上（左图），将胶囊中的样品粉末直接点击在Open Spot卡上

将OpenSpot卡插入ID-CUBE源即可运行

　　比如用ID-CUBE源连接Exactive，可对减肥药中的违禁成分西布曲明进行快速筛查，并用HCD高能碰撞解离后产生的AIF（全离子碎片）谱进行指纹表征。在该实验中，用Exactive外标法可快速获得所有分析物<3ppm的精确质量，而从ESI源更换到ID-CUBE源只需3分钟的时间，然后用不到1分钟的时间来优化样品的加热条件。分析每张OpenSpot卡片只需要10秒钟，不管是液体样品还是固体粉末，都可得到一致性的快速分析结果。

用Exactive连接ID-CUBE源，检测OpenSpot上的减肥药中的西布取明，A）理论的化合物m/z 280.13265；B）直接分析点在OpenSpot上的粉末，质量准确度-2.2 ppm；C）将样品粉末溶于5 uL乙腈点在OpenSpot卡上分析，质量准确度-2.7 ppm

用HCD高能碰撞解离后获得AIF全离子碎片指纹，产生主要的碎片离子 m/z 125.01518和m/z 139.03071

 

Orbitrap平台满足用户所有应用及预算

　　目前，赛默飞世尔科技Orbitrap整条产品线包括Exactive Plus、Q Exactive和Orbitarp Elite组合式高分辨质谱仪，能够满足用户各种不同的应用需求及预算。

Orbitrap质谱平台产品线

　　Exactive Plus属于高分辨质谱的基础设备，针对有精确分子量需求的用户，进行有机物定性、筛查定量分析等，且操作非常简便。从Exactive Plus升级到Q Exactive，在用户现场即可完成。

　　Q Exactive具有 “Quanfirmation”流程化的新功能，可在一次分析中同时完成化合物的鉴定、定量和确证分析。高性能四极杆质量过滤器用于母离子选择，可以获得选择性更好的MS/MS谱；在近期热点的高难度的蛋白质组学定量分析方面也有杰出的表现。

　　Orbitarp Elite组合式高分辨质谱主要针对一些前沿学科的应用，以及新方法的探索。该质谱具备超过240,000 FWHM的杰出分辨能力，采用高场Orbitrap分析器，可综合使用碰撞诱导解离(CID)，电子转移解离(ETD)和HCD的碎片互补检测技术，适用于自上而下蛋白质组学的研究。

　　谈到几种仪器的差别，王博士补充介绍到，Q Exactive和Orbitarp Elite这两款高端质谱可以提供更多种的Workflow（工作流程），能够针对更多特定领域用户的要求。而在具有140,000的高分辨率后，Exactive Plus在需要各种高分辨率/精确分子量分析的领域，也都有出色表现。

　　Exactive在国内已有的用户包括：从事中医药研究的院所、法医毒理部门、有机合成的研究单位、CIQ等法规检测部门等。王博士表示：希望能和更多国内的老师一起合作，建立一些解决食品/药品/环境等问题的高分辨质谱方法。

　　最后王博士总结到：目前赛默飞世尔科技拥有三重四极杆、离子阱和高分辨轨道阱三大质谱平台，为从定性到定量分析、从目标物到非目标物分析，提供全方位的工作流程解决方案，能够被广泛应用于生命科学、药物研发、食品安全、临床、法医检验等，帮助解决实验室各种具有挑战性的分析问题。