应用原子力显微镜分析苯甲酸钠生物毒性

  苯甲酸钠(Sodiumbenzoate，SB)又称安息香酸钠，是广泛应用于食品及碳酸饮料产业中的防腐剂。多年来世界上大多数国家一直允许用SB作为食品防腐剂，zui大允许量在0.15~0.25wt%之间，在美国，SB的zui大允许量为0.1wt%。随着食品工业的发展，食品中使用防腐剂的现象十分普遍。过去曾认为SB对人体无毒，但zui近的研究表明，其可造成人体组织器官或机能的损害，具有遗传毒性，使染色体分裂出现异常，使染色体发生结构畸变以致断裂并且会产生肝硬化、肌肉损伤[4]甚至致癌[5]，Tsay等发现SB能使斑马幼虫发生畸变。长期饮用含有SB的碳酸饮料易使儿童产生多动症。因此，SB的生物安全性和对人体的危害程度必然要引起我们的重视。

       原子力显微镜(Atomicforcemicroscope，AFM)是1986年由G.Binning，C.F.Quate和C.Gerber等发明的。自发明以来它就被广泛应用于对单细胞、细胞骨架、DNA、蛋白质等生物样品及其相互作用力的研究。目前在单细胞水平上研究SB致淋巴细胞形态及其膜超微结构损伤的影响尚未见报道。本研究利用AFM在单细胞水平提供有关SB毒性的可视化证据，并探讨其损伤机制。

1、材料与方法
1.1材料和试剂
       苯甲酸钠(C6H5COONa)，分子量:144.11，分析纯，天津市福晨化学试剂厂生产。Balb/c系小鼠购自中山医科大学实验动物中心;RPMI-1640、胎牛血清(Fetalbovineserum，FBS)及β-巯基乙醇等细胞培养试剂购自GibcoBRL公司。
1.2淋巴细胞的准备
       将Balb/c系小鼠断髓处死，在超净台内无菌分离双侧腋窝、锁骨下、腹股沟浅表淋巴结和肠系膜淋巴结，PBS清洗，去除被膜，机械研磨，于200目不锈钢网筛过滤。收集细胞，用4℃PBS1200r/min离心5min。洗涤细胞2次，重悬于RPMI-1640培养液(含10%FBS及50μmol/Lβ-巯基乙醇)，调整细胞密度为1×106/mL。台盼蓝染色观察细胞活力，活细胞数占98%。添加SB溶液至淋巴细胞培养液中，终浓度分别为0wt%、0.05wt%、0.1wt%和0.2wt%。将细胞在24孔板接种后放置于37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养1h、6h、12h、18h。
1.3样品制备
       分别取与不同浓度SB作用1h、6h、12h、18h后的淋巴细胞，滴于新剥离的云母片上，使其自然铺展，吸附10min，然后用2.5%的戊二醛(日本京都产)固定15min，用蒸馏水冲洗3次，室温自然干燥。
1.4AFM成像
       将制备好的样品置于AFM(AutoprobeCPResearch，Thermomicroscopes公司，USA)的XY扫描台上，用监视器定位所要扫描的样品区域，在空气中室温下利用接触或非接触模式成像。AFM图像仅经过自带软件(IP2.1版)的平滑处理，以消除扫描方向上的低频背景噪音。

2、实验结果
       经AFM扫描成像，获得了正常淋巴细胞、与不同浓度SB作用不同时间后的淋巴细胞的拓扑形貌图(Topography)和误差信号图(Errorsignal)，并分别对其表面超微结构进行了扫描分析，观察细胞数超过30个。检测结果发现，上述3种淋巴细胞均呈不同程度的形态结构改变。正常淋巴细胞呈较为规则的圆形，中间隆起，细胞表面总体较为平滑，高度在1.8~2.5μm之间，直径约为8~10μm。而与不同浓度SB作用后的淋巴细胞体积明显发生变化。高度减少，细胞表面形态结构更为复杂，中间部位出现明显破裂并且凹陷，呈“Y”型结构，边缘能观察到有细微损伤分布，并且随着SB浓度的增加，细胞形态进一步发生改变，呈中间凹陷状，细胞边缘向四周扁平铺展。细胞表面球状颗粒进一步增多，表面粗糙度增大，细胞高度明显减少，直径增加(高度由2μm逐渐减少至1μm，直径由6μm逐渐增加至12μm。对其局部小范围进行观察，AFM能清楚地观察到细胞膜密集的颗粒状突起物以及大量的孔洞，其中凹凸不平的细胞表面分布着大量小颗粒。选取不同细胞膜超微结构图的整个区域(5μm×5μm)进行测量，与SB作用后淋巴细胞的四个参数值均明显与正常淋巴细胞不同：对淋巴细胞膜形成的大小不一的颗粒进行统计，经SB作用后的淋巴细胞膜形成的颗粒逐渐增大。同时，随着与SB作用时间的延长，淋巴细胞出现的变化与上述情况类似，即作用时间越长，细胞损伤越严重，淋巴细胞的表面粗糙度也逐渐增加。

3、讨论
       AFM是样品表面信息的收集工具，较易获得细胞的形貌、超微结构及其生化反应后细胞形态变化等信息，是研究细胞损伤的有力工具。淋巴细胞是机体免疫应答功能的重要细胞成分，其形态结构与其功能息息相关。因此利用AFM研究淋巴细胞与外界环境相互作用前后细胞形态结构及其细胞膜的变化，对了解淋巴细胞的生理功能具有十分重要的意义。