总糖和还原糖的测定──3,5－二硝基水杨酸法

实验原理
在NaOH和丙三醇存在下，3,5－二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈桔红色，在540nm波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。

试剂和器材
一、试剂
3,5－二硝基水杨酸（DNS）试剂：称取6.5g DNS溶于少量热蒸馏水中，溶解后移入1000mL容量瓶中，加入2mol/L氢氧化钠溶液325mL，再加入45g丙三醇，摇匀，冷却后定容至 1000mL。
葡萄糖标准溶液：准确称取干燥恒重的葡萄糖200mg，加少量蒸馏水溶解后，以蒸馏水定容至100mL，即含葡萄糖为2.0mg/mL。
6mol/L HCl：取250mL浓HCl（35%～38%）用蒸馏水稀释到500mL。
碘－碘化钾溶液：称取5g碘，10g碘化钾溶于100mL蒸馏水中。
6mol/L NaOH：称取120g NaOH溶于500mL蒸馏水中。
0.1% 酚酞指示剂。
二、材料
藕粉，淀粉。

三、器材
试管1.5×15cm（×13）, 3.0×20cm（×1）；移液管0.2mL（×2），0.5mL（×2），1mL（×5）， 10mL（×1）；水浴锅；电炉；分光光度计。

操作方法

一、葡萄糖标准曲线制作

取6支1. 5 cmm×1.5cm试管，按下表加入2.0mg/mL葡萄糖标准液和蒸馏水。

在上述试管中分别加入DNS试剂2.0mL，于沸水浴中加热2min进行显色，取出后用流动水迅速冷却，各加入蒸馏水9.0mL，摇匀，在540nm波长处测定光吸收值。以葡萄糖含量（mg/mL）为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。二、样品中还原糖的提取

准确称取0.5g藕粉，放在100mL 烧杯中，先以少量蒸馏水调成糊状，然后加入约40mL蒸馏水，混匀，于 50℃恒温水浴中保温20min，不时搅拌，使还原糖浸出混。过滤，将滤液全部收集在50mL的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，即为还原糖提取液。

三、样品总糖的水解及提取

准确称取0.5g淀粉，放在大试管中，加入6M HCl 10mL，蒸馏水15mL，在沸水浴中加热0.5h，取出1～2滴置于白瓷板上，加1滴I-KI溶液检查水解是否完全。如已水解完全，则不呈现蓝色。水解毕，冷却至室温后加入1滴酚酞指示剂，以6M NaOH溶液中和至溶液呈微红色，并定容到100mL，过滤取滤液10mL于100mL容量瓶中，定容至刻度，混匀，即为稀释1000倍的总糖水解液，用于总糖测定。

四、样品中含糖量的测定

取7支15mm×150mm试管，分别按下表加入试剂：

加完试剂后，于沸水浴中加热2min进行显色，取出后用流动水迅速冷却，各加入蒸馏水9.0mL，摇匀，在 540nm波长处测定光吸收值。测定后，取样品的光吸收平均值在标准曲线上查出相应的糖含量。

五、计算

按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量：

式中：C──还原糖或总糖提取液的浓度，mg/mL；

V──还原糖或总糖提取液的总体积，mL；

m──样品重量，g；

1000──mg换算成g的系数。

注意事项

标准曲线制作与样品含糖量测定应同时进行，一起显色和比色。