薄层色谱法(thinlayerchromatography，TLC)

一、目的要求
1. 了解薄层层析分离和鉴定有机物的原理和方法；
2. 掌握薄层层析分离和鉴定有机物的操作步骤。
二、基本原理
薄层色谱具有设备简单、速度快、分离效果好、灵敏度高以及能使用腐蚀性显色剂等优点，是一种微量的分离分析方法。它可以与光谱或质谱结合起来，是一种很有发展前途的分析技术。
薄层色谱是把吸附剂或支持物（如氧化铝、硅胶和纤维素粉等）均匀地铺在一块玻璃板上形成薄层，将分离样品滴加在薄层的一端，当流动相沿着含有固定相的支持物上移动时，被分离组分就在固定相与流动相之间进行分配或吸附，经过反复无数次的分配平衡或吸附平衡，最后按照各个组分的差异而被分离。
三、基本操作
薄层色谱中，铺薄层的板可用玻璃板，也可用塑料板。铺在板上的吸附剂（或支持物）可分为加粘合剂的硬板和不加粘合剂的软板。薄层色谱技术包括制板、点样、展开、显色等步骤。现分述如下：
1. 薄层板的制备
薄层板制备的好坏直接影响色谱的结果，薄层应尽量铺得均匀，厚度在0.25～0.5mm之间。
硅胶和氧化铝的粘性差，使用前必须加粘合剂。市售的硅胶G 和氧化铝G 均已含有粘合剂半水石膏，可直接加入水调匀后铺层。

（a）1-玻璃板； 2-厚度垫板； 3-吸附剂； 4-有机玻璃尺
（b）1-玻璃板； 2-玻璃条； 3-有机玻璃尺； 4-吸附剂
（c）1-玻璃板； 2-玻璃棒； 3-控制厚度的金属丝； 4-吸附剂
图2.55 薄层板涂布法
薄层的涂布有倾斜法和平铺法等多种方法。倾斜法是将调匀的糊状物倒在玻璃板上，用手摇晃，使其表面均匀光滑，然后静置固化。平铺法是将调匀的糊状物，倒在玻璃板的一端，用一根均匀的玻璃棒（直径0.6～0.8cm），两端各绕一根不锈钢细丝（0.2～0.3mm）或镍铬丝，将糊状物均匀平铺，即可涂布成均匀的一层。涂布的时间、推移的速度力求均匀一致，最好一次推移完毕，不宜来回操作，如（图2.55c）。按上述方法涂好板后，静置让其固化晾干。
经室温干燥的薄层还要活化，所谓“活化”就是在高温除去水分，硅胶薄层和纤维薄层要在110℃下干燥1 小时，氧化铝薄层在80℃烘烤半小时，聚酰胺薄层要在110℃下干燥5min。活化后的薄层应放在干燥器内保存。
2. 点样
用毛细管或微量注射器取样品溶液，在上述制好的薄层板一端约1.5cm 处，，垂直地轻轻地接触到薄层上的吸附剂，样品溶液就可靠到薄层上。应分次点下，不可一次点得太多，不然样品点直径太大，样点直径一般以2～4mm 为宜。在定性和定量分析时，同一薄层上的样点直径应一致。
3. 展开
薄层的展开需要在密闭的器皿（如色谱缸、标本缸等）中进行，如图2.56。用来展开样品中各组分的溶剂（流动相）称展开剂。先将展开剂放在色谱缸中，盖上缸盖，让缸内溶剂蒸气饱和5～10min。再将点好试样的薄层板样点一端朝下放入缸内（切勿使样点浸入溶剂中），盖好缸盖，展开剂因毛细管效应而沿薄层上升，样品中组分随展开剂在薄层中以不同的速度自下而上移动而导致分离。当展开剂前沿上升到样点上方10～15cm时取出薄层板，放平，标明溶剂前沿位置，用电吹风冷风吹走溶剂。
4. 显色
经上述展开完毕并赶走溶剂的薄层板上分离的化合物本身有颜色时，可直接观察其斑点。若本身无色可先在紫外灯下观察有无荧光斑点，也可用显色剂喷雾显色。
5. 比移值（Rf值）
在固定的条件下（吸附剂、温度、展开剂等），不同化合物如甲和乙在薄层上以不同的速度移动，当停止展开后，各组分的色斑在薄层上的位置可用尺来测量，以比移值（Rf值）表示，如图2.57所示。

化合物甲的Rf 值 = a/c
化合物乙的Rf值 = b/c
最理想的Rf值为0.4～0.5，良好的分离Rf值为0.15～0.75，如果Rf值小于 0.15或大于0.75则分离不好，就要调换展开剂重新展开。
一种物质在固定的条件下有固定的Rf值，不同物质在相同的条件下可有不同的Rf值。因此，未知物与已知物（标准物质）在相同条件下进行展开比较Rf值可提供定性依据。
四、仪器药品
层析缸、玻璃研钵、层析玻璃板（5×20cm）、微晶纤维素粉、毛细管、喷雾器等氨基酸标准样品溶液、氨基酸溶液（红圆珠笔油乙醇溶液、 蓝圆珠笔油乙醇溶液）展开剂：正丁醇∶冰醋酸∶水=2 ∶1∶1
显色剂：0.5% 茚三酮正丁醇溶液
五、实验步骤[注1]
1. 薄层板的制备
取过160目筛孔的微晶纤维素粉3g 放于玻璃研钵中，仔细研磨，加入15mL蒸馏水，继续研磨成浆糊状后，倒在一块5×20cm 的干净干燥的玻璃板上。用玻棒推动纤维素粉状物使其涂满整个玻璃板，然后轻轻振动玻璃板，促使平整均匀。放置于水平实验台上让其自然晾干，再放入烘箱中于 80℃烘烤半小时取出放在干燥器内待用。
2. 点样
分别用毛细管在薄层板上离底边一端1.5cm处点上标准溶液和样品溶液，点与点之间的距离为1～1.5cm，并且各点要在一条线上。点样时应分次点下，样点直径一般以2～4mm为宜。同一薄层上样点的直径应该一致。
3. 展开
首先在层析缸周围衬垫滤纸，在层析缸内加入展开剂使液面高度为0.5～1cm。等展开剂饱和后（约5～10min），将点好样品的薄层板下端浸入展开剂中，但不能使样点浸入展开剂中。展开剂上升到10～15cm高时，取出层析板，标明溶剂前沿，用电吹风冷风将展开剂完全除去。
4. 显色
将除去展开剂的层析板均匀喷上茚三酮显色剂，然后置于80℃下烘干20～30min，即出现紫色斑点，取出后分别计算Rf值，并比较Rf值，判断未知试样中存在的物质。
六、思考问答
1．薄层层析分离物质的原理是什么?
2．用Rf值为什么能鉴定未知物?
3．薄层层析包括哪些操作步骤?
[注1]：圆珠笔油的分离操作方法同上。因圆珠笔油为有色物质，无需显色，其展开剂为正丁醇∶乙醇∶水=3∶1∶1。