植物基因转化技术

相关知识
植物基因转化技术是指将外源基因导入植物细胞或组织，获得转基因植物的技术。
植物基因转化技术总体上可分为两大类：1 以生物体为介导的基因转移法；2 DNA直接导入法。前者如农杆菌介导法，植物病毒介导法；后者如基因枪法、电击法、聚乙二醇法、脂质体法及花粉管通道法。其中应用最广的是根癌农杆菌介导法。
农杆菌介导法是将含有Ti质粒的农杆菌与组织培养的植物细胞或受伤的组织共培养，使外源基因进入细胞。转化的细胞在一定的培养基中可以再生出转基因植株。农杆菌介导的遗传转化系统两种：双元载体系统和共整合载体系统。双元载体系统需要两个彼此分离的质粒，一个是多功能克隆载体质粒，在大肠杆菌和农杆菌中都能复制。它应具备以下三个特点：（1）在其T-DNA末端序列内含单一克隆位点和植物选择标记基因；（2）T-DNA区以外含有细菌选择标记基因，以便选择转化菌株；（3）可以由大肠杆菌迁移到土壤农杆菌中。另一个是Ti衍生质粒，能提供反式的毒性区功能，以便T-DNA转移到植物中去。

无论是双元载体系统还是共整合载体系统，把中间载体质粒由大肠杆菌转移到土壤农杆菌中都需要三种细菌参与，通常称为三亲交配法。土壤农杆菌转化植物体的方法有多种。应用最广泛的是叶盘法。叶盘法非常简单：首先将叶片消毒，切成小块，与土壤农杆菌共培养一段时间，转到含有抗生素的选择培养基上。非转化细胞被抗生素杀死，转化细胞则在2-3周内长出愈伤组织和幼芽。

试剂仪器
含目的基因共整合载体或双元载体的根癌农杆菌
烟草幼苗
70%乙醇
0.1% 升汞
细菌液体培养基（pH 7.0）
共培养培养基(MS+1.0mg/L6-BA +0.1mg/LIAA)
选择培养基(MS+1.0mg/L6-BA +0.1mg/LIAA+l00mg/L Km+500 mg/mL Carb)
生根培养基(1/2 MS+100mg/L Km + 250 mg/L Carb)

摇床
分光光度计
恒温培养箱
保鲜膜、培养皿、剪刀、镊子、手术刀、小三角锥瓶

实验步骤
1．农杆菌培养：
（1） 挑单菌落接种到20 mL添加相应抗生素的细菌液体培养基（pH 7.0）中， 27度，180 rpm培养至OD600为 0.6-0.8。
（2） 取少量上述菌液，转入无抗生素的细菌液体培养基（pH 7.0）中，27度, 180 rpm培养至OD600为 0.2-0.5时即可用于转化。
2. 无菌受体材料的准备：
取烟草幼苗的叶片，蒸馏水冲洗1次，70%乙醇洗45秒，0.1%升汞消毒6-8分钟，无菌水冲洗5次，吸干。
将无菌叶片剪成 0.5 cm×0.5cm的小块，放在菌无小培养皿。
3. 侵染：
将菌液倒入上述无菌小培养皿，几分钟后取出叶片，吸去附着的菌液。
共培养：接种于共培养培养基上，25℃、黑暗培养2天。
选择培养：转移到选择培养基上25℃光照(每天16小时光照， 8小时黑暗)培养，每隔15天转移到新鲜的选择培养基上。
生根培养：待烟草芽长到4-5片叶时，从愈伤组织上切下烟草芽，转移到生根培养基上，15天后转移到新鲜的生根培养基一次。待根系发达后，小心取出带根系的烟草苗，尽量洗去粘附在根系上的培养基，移栽到土壤中．开始2-3天用保鲜膜保湿。