细胞凋亡及其检测技术1

细胞凋亡又称程序性细胞死亡（PCD）,是细胞衰老自然死亡的主要方式之一，在机体中承担着重要的调控作用。它不仅在维持细胞群体数量的稳定、胚胎发育和免疫系统的克隆选择方面，而且在肿瘤发生、发展、抗肿瘤药物的治疗等方面具有十分重要的作用。
细胞凋亡是由基因编程控制的细胞主动参与的自杀过程没事一种生理性调节机制，与细胞坏死的死亡机制是完全不同，与细胞凋亡相关的癌基因和抑癌基因有两类，一类是促进凋亡的，如C-myc、野生型p53、Fas和Fasl、bcl-xs、ICE、bak、bad等；另一类是抗细胞凋亡的，如突变型p53、bcl家庭的bcl-2、bcl-XT及病毒来源的BHRF1等，这两类基因与调控细胞凋亡密切相关。在肿瘤研究中，如果促凋亡基因活化和高表达，将会导致肿瘤的发生和恶化，用药后受抑，表明药物疗效好，预后佳，肿瘤发生与发展受抑制。反之，若促凋亡基因受抑，肿瘤则发生和发展。如果抗凋亡的基因活化和高表达将促进肿瘤的发生与发展，会导致肿瘤细胞耐药、预后不良；反之则肿瘤的发生与发展受抑，对放疗、化疗敏感，疗效好。由此可见，研究细胞凋亡不仅对研究组织和细胞的分化有理论价值，而且对肿瘤的发生和发展及临床治疗均有指导意义。

一、细胞凋亡的特征
细胞凋亡的特征是内源性核酸内切酶的激活，染色质DNA被有规律的切成整数倍的核小体片断，凝胶电泳呈梯形图像，电镜下可见有形态学变化，如细胞皱缩、胞膜完整，胞浆致密，染色质浓缩成新月形并断裂，有核膜包绕含核碎片的凋亡小体形成。经4，6-二脒基二苯基吲哚（DAPI）荧光染色，可见有细胞固缩，核断裂后形成大小不等的块状或颗粒状的荧光碎片。由于核断裂后形成小片断可透过膜而丢失，仅剩下大片断在流式细胞仪检测细胞周时可测出，称“G1”期的AP峰（即凋亡峰）。

二、细胞凋亡的分子机制
细胞凋亡是一个非常复杂的生理和病理过程，机体内多种因素可影响细胞凋亡的发生，如钙离子、镁离子、糖皮质激素能促进细胞内源性核酸内切酶活性，促进细胞凋亡，而锌离子能显著抑制钙离子和糖皮质激素这种诱导凋亡的作用，钙离子通道激活剂A23187可诱导细胞凋亡，但又可被内切酶阻断剂玫红三羧酸阻断。此外，类固醇、细胞毒性物质、秋水仙碱均能诱导细胞凋亡。

1、诱导细胞凋亡的因素或因子
诱导细胞发生凋亡的因素或因子很多，有些具有普遍性作用，如各种因素（射线辐射、热休克和紫外线照射等）导致DNA损伤，可诱导多种细胞发生凋亡。有些则具有一定的组织特异性，如糖皮质激素对淋巴细胞，转化生长因子-β1（TGF-β1）D对肝细胞的凋亡诱导作用。在胸腺细胞孵育的一个时期，T细胞抗原受体的诱导作用可导致胸腺细胞发生凋亡。在某些靶细胞中，肿瘤坏死因子（TNF）可诱导其发生凋亡，这些靶细胞便面具有TNF受体，其TNF受体与Fas同源。许多抗肿瘤药物可诱导肿瘤细胞发生凋亡，如多柔比星和道诺霉素、顺铂、长春新碱和秋水仙素等。

2、细胞生长因子去除后的细胞凋亡
越来越多的研究表明，最初被作为细胞增殖因子的多态生长因子中，有一些是细胞的存活因子，具有抑制细胞死亡，减少正常细胞丢失的功能，为多种类型细胞的存货所必需。几乎可以说，所有哺乳类动物细胞都要依赖于一种以上的生长因子来维持其存货，这些细胞生长因子对其靶细胞的细胞凋亡抑制作用并非特异，可被各种生长因子所替代。
去除生长因子诱发凋亡反应的机制，目前尚未完全弄清楚。不过，一些研究者提出，生长因子去除后，靶细胞受体获得的信号减少，引起信号传代途径的削弱，进而引发细胞许多基本功能的下调。例如，代谢速率减慢后，基因表达模式也会因此而发生改变。
Evan等人的实验表明，生长因子去除后基因的“不平衡“表达，对这些细胞的凋亡起关键作用。例如，IL-3依赖的祖细胞，去除IL-3后，细胞C-myc基因表达过度，加速了凋亡的发生。
（1）生理性激活剂：
TNF家族；Fas配体；TNF。
转化生长因子-β。
神经递质；谷氨酸；多巴胺；去甲基-D-天冬氨酸。
生长因子缺乏。
基质的丢失；附着体。
钙。
糖皮质激素。
（2）损伤相关诱导剂：
热休克。
病毒感染。
细菌毒素。
癌基因myc，rel，E1A。
肿瘤抑制因子p53.
细胞溶解性T细胞。
自由基。
抗氧化剂。
营养缺乏；抗代谢物。
（3）治疗相关因素：
化疗药物。顺铂；阿糖胞苷；长春新碱；甲氨蝶呤；多柔比星；争光霉素；氨芥。
γ射线。
紫外线
（4）毒素
乙醇。
β淀粉样。
3、细胞凋亡的抑制
对细胞凋亡具有抑制作用的因素主要有以下几个方面。某些癌基因或细胞凋亡相关基因具有抑制细胞凋亡的作用，如bcl-2、bcl-Xl（大分子蛋白）和突变型p53等。某些病毒感染靶细胞后，为延长其宿主细胞的寿命，以利其自身的修复，则移植宿主细胞发生凋亡。如EB病毒在宿主细胞中诱导bcl-2表达，并编码bcl-2基因 产物的同类物；腺病毒的E1B19000蛋白具有抑制细胞凋亡的作用。某些生长因子，如集落刺激因子（CSF）和神经生长因子（NGF）以及白细胞介素类(IL)具有抑制细胞凋亡的作用。正常的造血细胞因子，如粒-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、IL-3和IL-6对细胞毒抗癌药或TGF-β1所介导的细胞凋亡具有抑制作用，IL-6对野生型p53介导的细胞凋亡具有抑制作用，IL-4对用氢化可的松的介导的慢性淋巴细胞白血病细胞凋亡具有抑制作用。研究发现，在某些细胞凋亡发生过程中，存在大分子蛋白质的主动合成，某些药物如放线菌酮和放线菌素D，可通过抑制RNA和蛋白质的合成，抑制某些因素诱导的细胞凋亡。已报道的抑制凋亡物质如下。
（1）生理抑制剂：
生长因子
细胞外基质
CD40配体
中性氨基酸
锌
雌激素
雄激素
（2）病毒基因：
腺病毒E1B
杆状病毒p35
牛痘病毒CrmA
杆状病毒IAP
EB病毒BHRFI、LMA-1
非洲猪热病毒LMW5-HL
疱疹病毒34.5
（3）药理学因素
钙蛋白酶抑制剂
半胱氨酸蛋白酶抑制剂
肿瘤启动剂。PMA；苯巴比妥；α-六氯环乙烷。
易生物试剂库：http://www.ebioe.com/yp/product-list-43.html

4、细胞凋亡相关基因及其调节
许多研究资料表明，细胞凋亡的激发与抑制是受遗传因素影响的，有多种基因参与细胞凋亡的基因调控，其详细的机制目前尚不清楚。
多种对细胞凋亡具有诱导或抑制作用的基因，其中一部分是癌基因，一部分是应用减数杂交等方法从凋亡细胞中分离的特异性细胞凋亡相关基因。
(1)诱导基因:
野生型p53
去调节C-myc
c-rel
E1A-PBX1
腺病毒E1A
华美新小杆线虫ced-3、ced-4
APO-1Fas、CD3
TRPM-2
未成熟胸腺细胞凋亡相关基因。RP-2、RP-8
（2）抑制基因:
Bcl-2
PML-RARs
V-raf
C-fes
V-abl
H-ras
突变型p53
EB病毒LMP1
腺病毒ElL19、E314.7
单纯疱疹病毒γ34.5
杆状病毒p35
华美新小杆线虫ced-9

三、 细胞凋亡的医学意义
1、凋亡在发生学的作用
2、凋亡与疾病

四、细胞凋亡试验常用的方法
（一）药物对肿瘤细胞的抑制效应的MTT法：
用培养基将肿瘤细胞调整至2 X108个/L，在96孔板中每孔加入100ul细胞悬液于37℃、5% CO2下培养过夜。
次日每孔加入不同浓度的药物100mg/L作为试验组，设加完全培养基不加药物的阴性对照，并用功能明确的药物为阳性对照和0.5%的乙醇溶剂对照，每组均设4-6个复孔（平行孔）、37℃、5% CO2继续培养。
培养至12h、24h、48h、实验终止前4-6h加入10ulMTT（5g/L），培养4-6h后，阴性对照孔中已形成明显的蓝紫色颗粒结晶时加100ul/孔SDS-HCl终止反应，于37℃存放过夜。
用酶标仪在A570波长下测吸光度值，按下式计算抑制率
抑制率（%）=（1-试验组平均吸光度值/阴性对照组平均吸光度值） x 100%。