形形色色的蛋白标签（二）

　　体内标记

　　对于in vivo标记，人们通常用化学标记的营养物喂养细胞，让它们掺入新合成的蛋白、核酸或代谢物。之后收获细胞，分离出这些分子，从整体上查看细胞行为，或利用抗体或其他捕获试剂来研究某个蛋白。

　　蛋白质组研究人员常用的方法是SILAC，即细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记。两组细胞同时培养，A组是在包含正常氨基酸(light)的培养基中;B组的培养基则含有“重型(heavy)”的氨基酸，即稳定同位素标记的氨基酸。然后将两组细胞混合，提取出蛋白质组，并交给质谱去测定，从而评估两种条件下的蛋白丰度差异。生物通之前对此技术有详细介绍，请看《定量蛋白质组学之SILAC技术》。

　　而非质谱研究人员则使用所谓的生物正交(bioorthogonal)化学反应。在生物正交系统中，人们使用带有化学基团的分子来喂养细胞，这些化学基团与天然的生物活性基团(如胺基或羧基)不起反应。外源化合物(包含该基团的反应partner)的添加引发化学反应，从而将带标签的生物分子与功能基团偶联。

　　赛默飞世尔提供试剂，让叠氮化物与膦基团(phosphine group)偶联。在实验中，您可以用带有叠氮化物的分子来喂养细胞，然后，用含有膦基团的试剂处理细胞，它们就会发生反应。这两种化学基团一般不存在于生物系统中，因此这些分子是惰性的。

　　举个例子，在培养HK-2细胞时，您可以用N-azidoacetylmannosamine来标记新合成的糖蛋白。之后，用DyLight 650-phosphine处理，观察这些蛋白。

　　赛默飞世尔目前提供三种不同颜色的膦基团(DyLight 488-Phosphine、DyLight 550-Phosphine和DyLight 650-Phosphine)，以及生物素标记的膦基团，用于蛋白分离。

　　Life Technologies也有类似的点击化学试剂，名曰Click-iT，相当形象，不过它是基于铜催化的叠氮化物和炔烃之间的共价反应。当然，它也提供不含铜的试剂版本，用于活细胞应用，因为铜对于活细胞是有毒性的。

　　叠氮化物和炔烃都是惰性、稳定的，而且相当小。这些基团可交换，也就是说您可以选择一个来标记目标分子，而另一个用于随后的检测。Click-iT反应可监控新生蛋白的合成或抑制，取代BrdU检测细胞增殖，鉴定翻译后修饰(如糖基化和棕榈酰化)。标记试剂有7种可供选择，包括6种荧光基团和生物素。

　　这些试剂也可用于脉冲追踪实验。首先，用含有叠氮化物的分子和炔烃染料来标记新合成的蛋白，一段时间后，用含有炔烃的分子和不同颜色的叠氮化物染料来喂养细胞，就可以分辨新合成的蛋白与之前的蛋白。

　　体外标记

　　最后一类蛋白标签是在体外标记蛋白。除了常用的反应性化学试剂(如NHS酯)，一些公司也提供蛋白标记试剂盒，可实现多重质谱分析。这些试剂盒以同量异序标签(isobaric tag)标记蛋白。这些标签有着相同的分子量，因此在质谱上表现相同，但它们以不同的方式片段化，可在串联质谱分析中区分开来。

　　Life Technologies的iTRAQ试剂盒包括8种同量的胺活性试剂，能够对蛋白质水解的肽段进行标记，结合串联质谱的方法，可对肽段进行精确的鉴别和定量。这种技术通量高，一次可实现多达8个样品的蛋白质鉴定。它也能用于多个时间点蛋白质组动态变化的监测。

　　iTRAQ 技术的大体流程如下：样品一般先经胰蛋白酶裂解、烷基化、酶解为肽段，利用iTRAQ试剂多重标签对所产生的肽段进行差异标记，再将标记样本混合，最后用 LC-MS /MS进行分析。iTRAQ试剂包含8种不同的胺活性试剂。每种胺活性试剂与水解后肽段集合。胺活性试剂包含报告基团和平衡基团。

　　iTRAQ 技术可对复杂样本、细胞器、细胞裂解液等样本进行相对和绝对定量研究，具有较好的定量效果、较高的重复性，因此近年来应用较广。它适合所有类型的蛋白样品，而不像SILAC，不能对组织来源的蛋白进行分析。也正因为如此，它容易受样本中的杂质蛋白及样本处理过程中缓冲液的污染，需要对样本进行预处理并尽量减少操作过程中的污染。

　　赛默飞世尔也推出了串联质谱标签(tandem mass tag)试剂盒，被称为TMT，用于标记实验。TMT包含带有氨基活性基团的等量的串联质谱标签，一个质量归一化的连接子，一个可断裂的化学键，和报告离子 (reporter ion)系列。使用这些试剂，研究人员能在一个样本中专门标记肽和蛋白，然后进行相对或绝对的定量。该方法能够分析一个样品中每一个单独的蛋白，最多可同时分析6个样品。

　　不过，赛默飞世尔很快将会把TMT产品线升级为新的iodoTMT产品。据介绍，iodoTMT试剂只标记含有半胱氨酸的肽段，而传统的TMT试剂标记所有肽段。因此，研究人员可使用iodoTMT来研究不同条件下半胱氨酸特异的修饰，比如S-亚硝基化(S- nitrosylation)、氧化和二硫键。赛默飞世尔也提供固定化的anti-TMT树脂，可富集那些包含半胱氨酸的低丰度肽段，否则它们可能无法检测。

　　蛋白标签的选择真的很多，具体选择哪一个，这取决于您的应用。每个系统都不是完美的，都有优点和缺点。在选择之前您需要考虑：标签有多大?它是否会干扰相互作用?这个标签系统有多少种颜色可选?是否与您的应用兼容?当然，多看文献肯定没错。