细胞色素C的制备及含量、活力测定

  一、实验目的

    （1）通过细胞色序C的制备，了解制备蛋白质制品的一般原理和步骤

    （2）掌握制备细胞色素C的操作技术及含量的测定方法

    二、实验原理

    细胞色素是一类含有铁 啉基团的电子传递蛋白，只存在于需氧细胞中。细胞色素在线粒体内膜上起传递电子的作用。细胞色C (cytochrome c) 是细胞色素一种。它在线粒体呼吸链上位于细胞色素B 和细胞色素氧化酶之间，是呼吸链的一个重要组成部分。每分子细胞色素C含有一个血红素和一条多肽链。现已从许多来源获得细胞色素C结晶，并已对100多种细胞色素C蛋白的一级结构进行了测定。结果表明，细胞色素C的氨基酸残基的数目在103~113之间；不同来源细胞色素C的的氨基酸残基的顺序及含量都有一定的差异。细胞色素C中赖氨酸含量较高，等电点为10.7，含铁量为0.38%~0.43%，Mr为12000~13000，猪心细胞色素C分子量12200。细胞色素C是一种稳定的可溶性蛋白，它易溶于水及酸性溶液，故常用酸性水提取。细胞色素C分为氧化型和还原型两种，氧化型水溶液呈深红色，还原型水溶液呈桃红色。细胞色素C对热比较稳定，不易变性。pH 7.2~10.2, 100℃加热3分钟，细胞色素C氧化型和还原型变性程度均为18%~28%，若增加加热时间，氧化型的不可逆变性程度比还原型的为高。细胞色素C对酸碱也较稳定，可抵抗0 .3mol/L氢氧化钾溶液的长时间处理。一般都将细胞色素C制成还原型的，因为比较稳定并易于保存。

    三、试剂与器材

    绞肉机、电磁搅拌器、离心机、分光光度计、玻璃柱、下口瓶、烧杯等。

    四、操作方法

    材料处理—提取—中和—吸附—洗脱—盐析—沉淀—透析—测定

    五、关键步骤与注意事项

    ① 吸附前必须把人造沸石处理好,装柱时避免柱内出现气泡,沿柱壁缓缓流入柱内。

    ② 洗脱时洗脱液一旦变白，立刻停止收集。洗脱完毕人造沸石可再生使用。