1 使用管理
二氧化碳培养箱应由专人负责，设备的开关和调节旋扭一旦固定后，不要随意扭动，以免影响箱内环境参数。箱子的放置要水平，避免阳光直射和灰尘等，要保证仪器周围的气流循环，后部及侧面应留出5 cm的空隙。加入水箱的水必须是蒸馏水或无离子水，防止矿物质储积在水箱内产生腐蚀作用。
2 温度控制
培养箱温度调整是依靠加热管完成的，只能加热升温，如果室温超过设定的温度，培养箱内的温度将超温失控，室温最少应低于箱内最低设定温度5℃[5]，即如果箱内设定温度为37℃，那么室温不得高于32℃。
3 湿度控制
箱内湿度对于培养工作来说是一项非常重要然而又经常被忽略的因素。因为饱和湿度环境可以避免培养液中二氧化碳逃逸，培养液中pH值稳定，有利于细胞生长，足够的湿度水平并且要有足够快的湿度恢复速度（如在开关门后）才能保证不会由于过度干燥而导致培养失败。所以二氧化碳培养箱使用过程中，在箱内托盘中放足够的火菌水（3/2至全盘），使箱内成为饱和湿度环境。样本多时，箱内分区存放，培养物用筐或瓷盘存放，这样存取快速，缩短开门时间，减少箱内气体和湿度变化，节省气体，稳定了细胞生长环境。
4 二氧化碳输入压力控制
如果CO2探头接触CO2浓度过高会严重损害探头，所以要严格控制CO2输入压力，规范更换气瓶的操作，要熟悉减压阀的功能及操作，即反时针关闭，顺时针开启，在每次更换气瓶前必须将减压阀反时针松开至游离状态，安装好气瓶后再慢慢顺时针加压至0.06MPa。严格避免超压情况发生。
5 污染控制
二氧化碳培养箱的污染分为生物性污染、化学性污染、物理性污染和气溶胶污染[6]。使用前箱内应用消毒酒精或碘溶液彻底擦洗，防止其他微生物污染，另外三种污染以气溶胶污染更为常见，需要加强生物安全操作相关的培训，特别是进实验室前的培训，并且定期进行考核检查是十分必要的。
