质谱沙龙第三十八期活动报道

　　2013年5月19日，第三十八期质谱沙龙活动在航天中心医院报告厅如期举行。来自北京朝阳医院、航天中心医院、北京大学人民医院、 空军总医院、北京天坛医院、北京理工大学、北京肿瘤医院、AB SCIEX公司、北京艾米诺医学研究有限公司等质谱领域的专家、学者、技术工程师参加了本次沙龙活动。本次沙龙围绕生物等效性、新药临床前药代动力学、LC-MS/MS在药物监测中的应用等当面展开讨论，与会者畅所欲言，受益匪浅。

第三十八期质谱沙龙活动现场

　　活动伊始，质谱沙龙主办者来自北京朝阳医院医学研究中心的李鹏飞老师介绍到：质谱沙龙活动已获批北京市继续教育项目“质谱沙龙-质谱技术在医院临床药学科研中的应用，编号：2013-13-01-003（京）”，2013年计划举办质谱沙龙交流活动4次，共计I类学分10分。希望今后能够有更多的学者关注并参与质谱沙龙活动。

航天中心医院临床药理室 张丹老师

　　首先，来自航天中心医院临床药理室的张丹老师为大家详细介绍了题为《生物等效性实验室中的生物分析》报告。大量类别药品的开发和评价都会涉及到生物等效性（Bioequivalence，BE）实验，其中药物新剂型、仿制药等在完成BE实验之后便可上市。目前我国药品质量一致性评价中也更多关注到BE实验，这些导致BE实验在药品研发和评价中占据十分重要的地位。

　　生物等效性实验的分析方法包括药代动力学方法、药效动力学方法、临床比较实验方法、体外研究方法，其中药代动力学成为首选的分析方法，该方法采用药物制剂人体生物利用度原理，即测定不同时间点的生物样本（全血、血清、血浆、尿液）中的药物浓度，得出会与吸收程度与速度相关的药代动力学参数，并进行统计分析，最后判断两个制剂之间是否等效。因此生物分析对BE实验起到举足轻重的作用，其结果将直接影响BE实验的质量和结果。报告中，张老师所在实验室依据国内外指导原则结合实际工作，针对BE实验中的生物分析的几个关键问题进行分析研究，分别从分析物和分析方法这两大方面进行了具体的介绍。

　　BE实验中的分析物的确定及其影响因素

　　在分析物方面，张老师又分别介绍了BE实验中分析物如何确定以及相关的注意事项。不同于一般的PK研究，BE实验分析物确定的基本原则是该分析物的灵敏度足以区分两种试剂的吸收速度和吸收程度的差异。接下来，张老师分三部分详细讲解了BE实验中分析物应如何确定：（1）母药vs代谢物；（2）外消旋体vs 对映体；（3）多组分药物生物等效性分析，以及分析确定会遇到哪些影响因素。

　　母药vs代谢物

　　母药的C_max能够更灵敏的显示出两种制剂吸收速度的差异，因此无论母药是否有活性，都应该选择先测定母药。此外，当母药为前体药物时，该药物在体内的药时曲线因为血药浓度过低，或消除太快造成不完整的情况下，这时需要测定的是活性代谢物。如遇到母药和代谢物都有活性的情况下，此时应该测定的则为母药和主要活性的代谢物，但主要以母药的BE统计和评价为准，代谢物作为支持。

　　外消旋体vs 对映体

　　即选择非手性还是手性分析方法。EMA指导原则中指出通常可以采用非手性的分析方法，但不推荐。但当对映体同时满足具有不同的PK、不同的PD，以及体内暴露量受到吸收速度影响这三个条件时，则需要对每一个对映体采取手性的方法分析。如遇到其中一个对映体具有活性，另一个对映体无活性或活性较低，只需证明有活性的对映体的生物等效性即可。

　　美国FDA指导原则中推荐使用非手性方法进行BE实验；但当同时满足（1）不同PK、（2）不同PD、（3）至少其中一个对映体具有非线性吸收性质、（4）在体内暴露量较低的对映体对药效和安全性启决定性作用这四个条件时，必须采用手性的分析方法。

　　张老师所在实验室经过多年的实际工作，得出对于手性药物的BE实验应采用手性分析方法；在不增加BE实验结果风险性的情况下，当遇到两个对映体之间没有立体选择性；或者没有活性或活性较低的对映体在体内的暴露量较低时，可以采用非手性方法代替手性方法。

　　多组分药物分析

　　FDA指导原则中指出多组分药物分析中分析物的确定应选择能够灵敏的显示吸收速度和吸收程度差异的标志化合物。该标志化合物要综合其在制剂中的含量、在体内浓度水平的高低、及其活性的大小。我国SFDA指导原则中要求每个化合物均需分析检测。

　　分析物确定的影响因素

　　即共存物质和共流出物质对分析物的确定。FDA和EMA指导原则中均指出分析时要考察同时存在的药物是否对分析物造成影响。此外，在进行方法开发和方法确证时，确保使用的生物基质和采集样本时的基质一致。以及现在比较热门的溶血和高脂的基质对分析物确定的影响。报告中，张老师具体介绍了代谢物对分析物确证的影响。代谢物不一定共存在方法确证的生物样本中，因此会给分析带来很多困扰，例如交叉效应、源内裂解、转化。张老师依次例举了分析实例，介绍了如何处理代谢物在BE实验中对分析物确证带来的影响。

　　BE实验分析方法的特殊性

　　最后，针对BE实验的特殊性，张老师介绍了其分析方法。由于BE实验中得出PK参数后需完成BE统计，进行方差分析。因此需要考虑试剂间的差异、周期间的差异、序列间的差异等。因此在BE实验中，如果生物分析的不理想，势必会成为方差分析误差大小的来源。针对上述问题，张老师在报告中从分析检测、分批处理问题、盲测和揭盲，复测和已测样品再分析，以及异常值这五个当面介绍了BE实验分析中应注意到的问题。

北京大学人民医院药剂科的副主任药师 赵立波老师

　　来自北京大学人民医院药剂科的副主任药师赵立波老师为大家带来了题为《利用液质联用技术研究黄酮类化合物对P-gp在中枢转运HIV-蛋白酶抑制剂的影响》的报告。

　　由人免疫缺陷病毒（HIV）引起的获得性免疫缺陷综合症（AIDS，艾滋病）已经成为威胁人类健康的最大传染性疾病之一。据WHO报告：2010全世界存活HIV携带者及艾滋病患者共3400万，新感染270万，全年死亡180万人。每天有超过7000人新发感染。中国CDC估计，截止至2011年底，我国存活HIV携带者及艾滋病患者约78万人，全年新发感染者4.8万人，死亡2.8万人；目前我国面临艾滋病发病和死亡的高峰期。据赵老师介绍，HIV蛋白酶抑制剂是治疗HIV-1感染的一线药物，但由于HIV-1频繁变异，单药耐药和多药交叉耐药发生率较高，导致HIV-1病毒（尤其是脑内的病毒）清除不彻底。

　　黄酮类化合物对P-gp在中枢转运HIV-蛋白酶抑制剂的影响

　　P-糖蛋白（P-gp）能够抑制住血脑屏障上的活性外排转运体，使得药物被充分吸收。目前国内外学者已对大量P-gp抑制剂进行了较多研究工作，例如维拉帕米、酮康唑、PSC833等。但到目前为止，已经发现的P-gp抑制剂存在或抑制强度不够、或毒性较大等原因，均难以应用于临床。

　　针对上述问题，赵老师所在课题组提出试图寻找一种合适的化合物可抑制人类脑部P-gp，作为抗HIV蛋白酶抑制剂的增敏剂。经研究发现，许多黄酮类化合物如铄精、桑色素、异黄酮和黄酮醇等能够抑制肠道P-gp，增加药物的吸收。黄酮类化合物来源广泛，广泛分布在植物的根茎叶花及水果、茶叶中；毒性小或无毒，与人体具有良好的相容性；具有协同抗病毒活性，能够作用于逆转录酶和整合酶；且具有增强机体免疫功能，刺激机体的免疫系统产生TNF、IFN、IL等细胞因子。因此赵老师课题组边便开展了黄酮类化合物对P-gp在中枢转运HIV-蛋白酶抑制剂的影响研究工作。

　　报告中，赵老师详细介绍了该课题组（1）以蛋白酶抑制剂利托那韦为例，建立生物样本中低浓度利托那韦浓度HPLC-MS/MS方法的建立；（2）在细胞模型筛选具有P-gp逆转作用的黄酮类化合物；（3）在整体动物确定黄酮类化合物对利托那韦药动学（主要是脑内分布）的影响；阐明黄酮类化合物对P-gp外排作用的影响及其分子机制；为开发高效低毒的P-gp逆转剂（作为蛋白酶抑制剂曾敏剂）提供有价值的实验和理论依据。

北京朝阳医院药学研究中心的主管药师 李鹏飞老师

　　来自北京朝阳医院药学研究中心的主管药师李鹏飞老师带来了题为《LC-MS/MS定性和定量研究2种硝胺化合物》的报告。

　　硝胺类化合物主要用于推进剂中的氧化剂和高能单质炸药，常见的有黑索金（环三亚甲基三硝胺）和奥克托金（环四亚甲基硝胺）两种。硝胺类化合物可造成中枢神经系统毒性，引起功能性紊乱、器质性损伤；导致血液系统毒性，红细胞、白细胞、骨髓损伤，引起高铁蛋白血症；导致肝脏毒性，引起急性肝损伤、干细胞坏死、过敏性肝炎；以及呼吸道毒性，引起窒息、肺水肿、化学性肺炎。

　　目前硝胺类化合物在体外定量方面研究较多，并形成一定成果，例如采用检测管和检测仪法测定空气样本；以及荧光法、LC-UV、GC、LC-MS、LC-MS/MS方法测定环境样本，检测限低至pg级。但硝胺化合物在体内的研究较少，因此李老师所在实验室利用LC-MS/MS平台，建立体内复杂生物基质中索金和奥克托金同时定量的分析方法，以及为临床硝胺化合物中毒的早期预警及有效治疗提供方法支持。

　　报告中，李老师具体介绍了硝胺化合物的质谱行为研究、建立硝胺化合物的体内LC-MS/MS定量检测方法、硝胺化合物在大鼠体内的药物代谢动力学研究、以及静脉给予硝胺化合物后大鼠的病理组织学研究。

　　体内LC-MS/MS定量检测方法

　　在体内LC-MS/MS定量检测方法的建立研究中，李老师所在实验室通过方法学特异性、精密度与准确性、标准曲线和定量限、提取回收率和基质效应、稳定性考察一整套方法学验证后，得出硝胺化合物的体内LC-MS/MS定量检测方法采用负离子离子化模式，流动相中不添加任何试剂，样品前处理采用一步蛋白沉淀的方法。

　　药物代谢动力学研究

　　药物代谢动力学研究中，对RDX和HMX的CL值进行t检验，发现有显著性差异（P<0.05），表明RDX和HMX在体内清除速率有差异；RDX静脉注射的t1/2为324.68 min，HMX静脉注射的t1/2为134.88 min，RDX比HMX消除慢。RDX和HMX的Vd值有显著性差异（P<0.05），表明RDX和HMX迅速在体内分布，其中血液中分布比例较小，且HMX在血液中分布比例比RDX小。

　　最后，李老师表示该分析方法具备两大创新：（1）国内首次建立硝胺化合物体内定量分析方法；（2）国内外首次将LC-MS/MS技术应用于硝胺化合物体内分析。并且该LC-MS/MS方法最低检测限可达0.5ng/mL。

空军总医院药学部主任药师 梁贵键老师

　　来自空军总医院药学部主任药师梁贵键老师为大家带来了《基于“科学•文化”双视角和“液相色谱•质谱•药品标准•体内分析”四维度初谈“我的梦•中国梦”》的报告。报告伊始，梁老师通过自己几十年的色谱分析工作，谈及了自己对“科学•文化”在分析工作的一些体会和看法。并再次介绍了其提出的“二分五性三码一谱”解决体内药物快速分析的新策略。

　　目前建立药物色谱分析方法仍处于反复摸索的偶然或然状态，或借助单纯形、窗口图法、重叠分辨率法和均匀设计等优化方法。与其紧密相关的基础性问题，至今未得到系统的研究。

　　要解决这样的问题，必须全面掌握内源性物质和常用药物的色谱行为以及预处理后被除去、纯化和富集的数据和规律。药物分析是高效液相色谱技术得到最广泛应用的领域，在药物HPLC分析中，国内外迄今还没有一个基于实验数值型数据库或能对流动相组成、内标选择和样品预处理方法三者进行推荐和仿真模拟的专家系统。梁老师所在实验室分析了300多种药物的色谱行为，提出了“二分五性三码一谱”解决体内药物快速分析的新策略。

“二分五性三码一谱”新策略

　　 “二分”从分析样品性质上区分是药品分析还是生物药物分析，从药物结构上分清被测药物的酸碱性。“五性”即色谱性、检测性(响应性)、稳定性、 回收性和商品性。“三码”即色谱码、检测码和回收码。“一谱”即内源性干扰三维码。该方法的意义和作用可概括为：二分定原则，五性选药物，三码找方法，一谱除干扰。

北京艾米诺医学研究有限公司 苏晶博士

　　来自北京艾米诺医学研究有限公司的苏晶博士介绍了题为《新药临床前药代动力学研究》的报告。

　　临床前药代动力学研究可以获得一些重要的药动学参数，为设计和优化临床研究给药方案提供理论依据，了解药效或毒性的靶器官，阐明药效或毒性产生的物质基础，对拟定解毒措施有极其重要的知道意义。

　　苏晶博士阐述了临床前药代动力学的注意事项。实验药品选择上应提供受试药物的名称、批号、来源、纯度、保存条件及配制方法。实验动物常选择小鼠、大鼠、兔、豚鼠、犬和猴等。动物体内药代动力学研究应设置至少三个剂量组，给药途径和方式应尽可能与临床用药一致。方法学考察中考虑药物在血浆中在线性范围内线性关系良好，精密度和准确度符合要求，提取回收率不低于80%，在室温放置24h，-20℃冻藏45d、3次冻融循环和处理后的待测样品在进样器中（4℃）4h的稳定性均符合要求。

　　在此基础上，苏晶博士取雌雄各半的SD大鼠通过单剂量灌胃给药和单剂量静脉注射进行了大鼠生物利用度的研究，首次建立了大鼠血浆中药物的LC-MS/MS分析测定方法，并将其成功应用于药物单剂量口服给药后在大鼠体内的药代动力学研究。该方法专属性强，且具有较高的灵敏度。药物在一定剂量范围内的药物动力学过程具有线性特征。即使在高剂量给药条件下，药物仍能够在动物体内正常代谢并顺利消除。对于难溶性药物，在水和乙醇中溶解度很低，尝试以二甲胺（DMA），后稀释在聚乙二醇和生理盐水中（二甲胺：生理盐水：PEG400=1:5:5，v/v/v）制成溶液剂给药，获得药物在大鼠体内的生物利用度。而在反相色谱系统中存在很严重的拖尾现象，尝试在水相中加入三乙胺，用磷酸调节水相pH值，乙腈-0.2%磷酸水溶液（含0.5%三乙胺）（69:31，v/v），峰型最好，与干扰物质分离度也较好。除此以外，在肺肝脾等器官中，均有较高浓度水平的药物被检出，该药物在生物体内分布广泛，十分有利于其药理作用的发挥，在动物脑中亦检测到药物的存在，说明该药物可透过血脑屏障。同时还利用HPLC-MS-MS技术鉴定了大鼠灌胃给药血浆、胆汁、尿液和粪便样品中原形药物和代谢产物，对这些化合物进行了电喷雾离子化质谱分析（MSn，n1-2），推测了各个代谢物的化学结构。依据提取离子色谱图中各质量数下对应色谱峰的绝对强度判断出I相代谢氧化产物和II相代谢的葡萄糖醛酸结合产物为其最主要的代谢形式。

　　目前新药药代动力学研究中常使用HPLC/MS研究药物的吸收阶段，在药物的分布和排泄研究中常使用HPLC-UV方法，在代谢阶段研究常使用HPLC-MS/MS方法。

AB SCIEX公司亚太应用支持中心 黄江博士

　　来自AB SCIEX公司亚太应用支持中心的黄江博士带来了题为《AB SCIEX质谱技术在临床研究分析中的应用》报告。黄江博士主要介绍了LC/MS/MS在临床研究分析的现状和应用实例。

　　通过经济上的考量、受实验结果报告周期、样品分析的具体需求和添加新检测方法的能力等多因素推动， LC/MS/MS在临床研究中的应用越来越广泛。目前应用领域有TDM（临床治疗药物监测）中免疫抑制剂、抗逆转录病毒、抗精神病药物、抗惊厥、抗病毒、苯二氮的测定；IEM中脂肪酸、氧化障碍、氨基酸、有机酸障碍、血红蛋白病、LSDs（溶酶体贮积症）等的测定；生物标记物中类固醇、维生素D、同型半胱氨酸、乳清酸、胆汁酸、肿瘤标志物和T3/T4的测定；临床有毒有害物质中一般未知物的筛选、药物的滥用、止痛药和Opiates的测定。AB SCIEX公司从事临床研究领域应用长达10年之久，在全球临床研究市场已安装超过500套系统，已经建立许多完善的检测试验方法。黄江博士强调：将来，AB SCIEX公司将更加重视和承诺为客户提供新产品的开发和技术支持，不断和客户一起合作开发新的应用方法。目前Mayo、ARUP、Quest、CDC、NIH、Kaiser实验室都和AB SCIEX有合作。

　　AB SCIEX之所以有这么多合作来源于公司综合质谱的强大优势。AB SCIEX质谱系统包括第一流的硬件和简单易用的软件，结合客户的实际需求建立专用的应用方案，使客户能够快速建立常规运作。AB SCIEX公司拥有适合食品和饮料、制药、临床和法医、环境的综合质谱产品系统。质谱系统配有独特的Turbo V离子源，独特的Curtain Gas气帘器接口，独特的LINAC线性离子加速碰撞室技术，独特的QTRAP混合三重四极杆和离子阱技术，再加上临床研究领域的iMethod Tests软件，使得AB SCIEX质谱成为临床研究领域的最有力工具。

　　黄江博士具体讲解了质谱分析TDM、新生儿筛查、维生素D和类固醇、临床毒物筛查的实验实例。LC-MS/MS在免疫抑制剂测定中具有很多优势。多种免疫抑制剂可以同时检测和定量，只要少量样品就可以得到高灵敏度结果，仪器选择性好，在复杂基质中干扰小。选择on-line样品净化，减少样品前处理，能够测定3-4个数量级浓度范围。LC/MS/MS分析维生素D可以节省溶剂、分析范围广、不要求特异性，一针进样可以同时分析多种成分，很可能取代免疫法成为类固醇类分析的主要方法。

　　最后黄江博士介绍了目前在国外AB SCIEX已经研发开展的临床领域的人们新领域。在医院有维生素D、尼古丁代谢物、生物标志物和临床毒物筛查的检测。在政府机构主要用于酒后驾车测定酒精代谢物，K2粉及其代谢物，兴奋剂和抗抑郁剂的检测。还有军队、飞行员的滥用药物筛查领域。