【导语】用液相色谱法分离分析多肽或一些小蛋白的方法已经很成熟,但若要分析较大的蛋白质分子,科学和工业界都会选择电泳技术,比如在生物制药行业中做提纯后蛋白质的分析表征。不过,不管是凝胶电泳还是传统的毛细管等电聚焦,电泳实验可真不是好做的,方法开发困难、实验时间长、重现性差、操作复杂、线性范围窄等等一系列问题,让实验者头痛不已。从上世纪90年代末开始至今,很多国内外文献都报道了一种全柱成像毛细管等电聚焦技术,可以突破以上电泳技术的种种极限,并给予蛋白质分析实验者各种应用和想象的空间。加拿大AES公司推出的CEInfinite型全柱成像毛细管等电聚焦电泳仪(cIEF-WCID),正是这种新技术的成功商品化应用。近日,小编有幸采访到AES公司的总裁兼CEO黄铁民博士和北京绿绵科技有限公司欧阳伟民总经理,他们将为我们详解CEInfinite在蛋白质分析中的应用,希望对所有关注蛋白质分析的研究者有所帮助……
AES公司总裁兼CEO黄铁民博士(左)与北京绿绵科技有限公司欧阳伟民总经理(右)合影
CEInfinite 全柱成像毛细管等电聚焦电泳仪(cIEF-WCID)
全柱成像毛细管等电聚焦电泳仪(cIEF-WCID):
不移动已聚焦固定的蛋白质区带,直接“拍照”检测
谈到cIEF-WCID的定义,先得谈谈IEF和cIEF的由来。
名词解释:
IEF:等电聚焦电泳,iso-electric focusing electrophoresis
CE:毛细管电泳,capillary electrophoresis
cIEF:毛细管等电聚焦电泳,capillary iso-electric focusing electrophoresis
cIEF-WCID:全柱成像毛细管等电聚焦电泳,capillary iso-electric focusing electrophoresis -whole column imaging detection)
等电聚焦电泳IEF技术是表征蛋白质及其他生物高分子的一种主要方法。在生物制药行业,IEF是一种有30年历史的常规方法,用于生产过程分析、药物制剂研究分析及最终产品的质量控制分析,最早是用凝胶IEF实现。然而,作为一种重要的蛋白质分析方法,凝胶IEF分析基本上是非自动化的手工操作,分析速度慢、只能半定量。早在70年代末80年代初大家就认识到,如果IEF技术能转移到分离柱里进行操作,它的分析速度、自动化程度及定量分析的能力就会大大地提高。毛细管为分离柱的IEF方法即毛细管等电聚焦cIEF在1985年被首次报导。它是将带有两性基团的样品、载体两性电解质、缓冲剂和辅助添加剂的混合物注入毛细管内,当在毛细管两端加上直流电压时,载体两性电解质可以在管内形成一定范围的pI梯度,样品组分依据其所带电性向阴极或阳极泳动,柱内pI值与该组分的等电点(pI)相同时,溶质分子的净电荷为零,宏观上该组分将聚集在该点不再进一步迁移,达到使复杂样品中各组分分离的目的。
过去,cIEF方法是用商品通用毛细电泳CE(capillary electrophoresis)仪器来完成的,我们称之为传统单点检测cIEF。起初人们对这种传统cIEF报有很大希望:因为使用分离柱操作IEF,将会减少样品用量,大大提高分析速度,实现自动化及定量。科学界内期望cIEF被长期使用凝胶IEF技术的分析人员所接受,进而在生物制药行业内代替凝胶IEF技术。但是,这些期望没有实现。究其原因,主要是用通用CE仪器来做传统单点检测cIEF方法有很多不可克服的困难。
传统单点检测cIEF的主要问题是移动过程(mobilization process)。在IEF聚焦过程结束时,各蛋白质组份都已在毛细管内形成不移动的窄区段。但由于通用CE仪器的检测器都是单点检测器,用这种仪器去检测那些不动的蛋白质区段就要有一个移动的过程——把这些已经聚焦好、固定好的蛋白质区段,再推到单点检测器的检测点。传统单点检测cIEF技术的困难与麻烦都是来自这个移动过程。凝胶IEF虽然没有这个过程,但产生的最大问题是分辨率差,方法优化麻烦,分离时间长及重现性不好。
那么,是否可以开发一种既利用了毛细管等电聚焦电泳高速、高分离度的特点,又能直接检测已固定聚焦好的蛋白区段的技术?
这时,人们会想到“照相”,透过毛细管,对这些聚焦好的区段直接拍照不就行了?
不过,真正设计成仪器,就得考虑透过毛细管拍照的速度、灵敏度、线性范围、实际操控的方便性、稳定重现性等等一系列问题。
终于,CEInfinite型全柱成像毛细管等电聚焦电泳仪cIEF-WCID(whole column imaging detection)横空出世,它是电荷耦合装置 (CCD) 成像技术和微分离技术发展到一定高度后的产物,CEInfinite利用更为先进的CMOS成像技术对整个微分离通道(长度通常为3-8厘米)内的分离进行成像检测,检测信号可以是紫外吸收、折射指数梯度或激光诱导荧光。
单点检测毛细管电泳原理图:将待分析溶液引入毛细管进样一端,施加直流电压后,各组分流向毛细管出口端,按阳离子、中性粒子和阴离子及其电荷大小的顺序通过检测器。依据迁移时间确定样品,利用朗伯-比尔定律对样品进行定量。但是普通毛细管电泳分离能力较弱、分析时间长、对PH值要求高,且重现性差。
全柱成像毛细管电泳技术的原理图:在高压下,样品通过具有涂层柱的毛细管,根据蛋白质pl点的不同在毛细管内聚焦,CMOS照相机可以直接检测不同蛋白质的pl点。撤掉电压后,样品峰经过扩散,利用朗伯-比尔定律可对样品进行定量,并可进行分子量测量、或对分子间相互作用进行研究。
CEInfinite型cIEF-WCID和传统单点检测cIEF、凝胶IEF的比较
分析速度:远远超过其它技术
在蛋白质pI点测定这个最核心的传统项目上,CEInfinite cIEF-WCID(全柱成像毛细管等电聚焦电泳仪)耗时小于10分钟,传统单点检测cIEF 45分钟,凝胶IEF 400分钟。
cIEF-WCID (红色); 传统单点检测cIEF(cIEF,绿色)和凝胶等电聚焦(Gel IEF,兰色)的分析时间比较
全面比较:CEInfinite处处领先
|
凝胶IEF |
传统单点检测cIEF |
CEInfinite cIEF-WCID |
实验难度 |
高 |
低 |
低 |
自动化 |
不行 |
可以 |
可以 |
pI测定和峰鉴定 |
不准确 |
准确 |
准确 |
定量 |
不行 |
可以 |
可以 |
分辨率 |
很差 |
较好 |
极佳 |
重复性 |
很差 |
还可以 |
非常好 |
pI范围 |
窄 |
宽 |
非常宽 |
方法运行时间 |
非常长 400分钟 |
长 45分钟 |
短, 小于10分钟 |
方法开发时间 |
非常长 |
长 |
短 |
与传统单点检测cIEF的技术细节比较
原理上,两者的区别很大;在实际的技术细节上,CEInfinite也显示出强大的优势。
参数 |
传统单点检测cIEF |
CEInfinite |
CEInfinite的优势 |
分离柱内径 |
小于75微米 |
100-250微米 |
光程更长,灵敏度更高 |
电压 |
高于2万伏 |
低于0.5万伏 |
操控更简单、更安全 |
柱长 |
长于40厘米 |
3-5厘米 |
分析时间更快 |
是否需要电渗流 |
需要电渗流 |
不需要电渗流 |
操控更简单 |
是否需要多次清洗 |
需要多次清洗 |
不需要多次清洗 |
操控更简单 |
方法的建立 |
建立方法困难 |
建立方法非常容易 |
对研究和检测都更有利 |
线性范围 |
线性范围窄 |
线性范围宽 |
更适于定量 |
重复性 |
重复性差 |
重复性媲美HPLC |
更适于定量 |
与凝胶IEF比较——更快、更省、更人性化
黄博士表示:“凝胶电泳是最传统的技术,需要的分离时间长,需要大量的人力物力,也需要消耗大量的消耗品,它的结果只能是半定量,不能完全定量,而且不能实现自动化。而CEInifinite全柱成像毛细管等电聚焦电泳保持了凝胶电泳直观和高分辨率;具有快速,自动,定量的特征;方法建立简单,重复性好,检测线性范围宽;还具有成像检测独有的多参数分析。”
“目前,我们已利用微流控技术,将CEInfinite和质谱联用。可以摆脱传统双向凝胶电泳和质谱分析技术在离线分离分析方面的种种困扰,并解决传统单点聚焦CE-MS联用的种种历史遗留问题,大大推动蛋白质组学、生物医药研发等领域的发展。”黄博士兴奋地表示。
CE-WCID的技术优势
CMOS照相机——检测整个分离通道内的各组分的动态变化
CEInfinite采用照相机CMOS(Complementary Metal-Oxide-Semiconductor Translator,互补性金属氧化物半导体)作为成像检测技术,代替了传统的CCD成像技术,具有高速数据采集、宽线性范围、绿色节能、超高检测灵敏度和和仪器稳定性等优势,这是其成为蛋白质分析的黄金技术和工业标准的重要基础。
拥有最全的pI标记物和CEInfinite两性pH载体
所谓好马配好鞍,做好cIEF-WCID全柱成像毛细管等电聚焦电泳实验,除了好仪器,还要有好配套。和CEInfinite系统配套的是:
(1)目前世界上最全的pI标记物(pI Marker):30种pI Marker(pI点范围:2.8 ~11);相当于给CEInfinite提供了准确的刻度尺,保证每次实验的准确、精确。
(2)最完善的pH载体(carrier ampholytes):四种专利化独有的Aeslytes pH 3-10、Aeslytes pH 2.5-5、Aeslytes pH 5-8 和Aeslytes pH 8-10.5,并可以根据客户需要定制高分辨的pH范围。相当于提供了4种量程,大大方便实验的操作、提高分析速度和质量。
AES专利化合成的高准确度和高化学稳定的pI Marker
CEInfinite Aeslytes 超高分辨率的pH 载体 (与其它商品化的pH 载体相比,具有更高的pI分辨率和稳定性)
,出色的重复性和超高分辨率
CE-WCID(全柱成像毛细管等电聚焦电泳仪)具有超高的蛋白质pI点的分辨率(△pI<0.01),这个指标无人能比。
蛋白质pl点的测定举例:△pI<0.01,7分钟完成实验
蛋白质药物主要成分和降解产物的pl点测定和重复性的考查
CE-WCID(全柱成像毛细管等电聚焦电泳仪)连续50自动进样分析出色重复性、高分辨率和准确的pI点测定
“一机多用”
CEInfinite是多种蛋白分析表征仪器的结合体,一种设备承担了多种分析的能力,它是蛋白质分离分析仪、是pl测定仪、是分子量和扩散系 数测定仪、是蛋白质相互作用表征仪。一种仪器、一种分析模式就能完成所有蛋白分析的整体应用和表征,甚至一次分析能获得多种应用结果。而传统CE必须通过 复杂的操作机理完成不同的应用,实用性很差。
强大的自动进样系统(Alcotte719)和数据处理软件
高通量、自动化和功能强大的数据采集和处理软件
CEInfinite拥有超高稳定性的自动进样系统(Alcotte719)和功能强大的操作和数据处理软件,具有自动数据匹配、pI值自动软件计算等功能;
稳定的CEInfinite涂层柱
CEInfinite涂层柱
完善和多样化的涂层毛细管Cartridge,极大提高了蛋白质分离的灵敏度和分辨率。毛细管Cartridge上具有高稳定性的涂层,极大提 高了有效使用时间;涂层具有化学惰性,无需清洗,可连续使用,且对样品添加亲水聚合物无要求。如果横向比较的话,一根色谱柱有多长使用寿 命,CEInifinite提供的涂层毛细管柱就有多长寿命。
高性能CEInfinite分离柱盒
CEInifinite具有专有的高性能分离柱盒,其上集成了散热片,具有合适的光学狭缝,保证高检测线性范围;专有膜技术保证重复和高速进样的能力。
CEInfinite:拓展蛋白质分析无限想象空间
一、蛋白质pI的测定:黄金技术和工业标准
CEInifinite可直接、准确、快速的蛋白质 pI点测定:分析时间小于10 分钟,分辨率△pI<0.01,测定准确而且重复性出色,常规方法难以与其相比拟。在生物制药行业,可用于生产过程分析、药物制剂研究分析及最终产 品的质量控制。在生物药品制品的法规检测部门,CEInfinite同样将发挥巨大潜力,因为它对操作人员的要求不高,实验非常准确快速,便于方法推广和 法规监督的落地执行。
参考:蛋白质pI的测定应用
二、蛋白质分子量和扩散系数的测定:一次实验实现2D分离
CEInfinite除了可以根据蛋白质等电点不同进行快速分离和定量,接下来可以用峰参数直接计算扩散系数和分子量大小,而且一次实验就可以 完成。传统上,这种工作时由双向凝胶电泳完成的,第一维在固定化胶条上使蛋白质按等电点分离并固定;然后在第二维SDS-PAGE上,按照分子量分离蛋白 质;然后用扫描仪检测;最后用软件分析。双向凝胶电泳的整个实验耗时需几天。而且由于步骤中间有样品转移等过程,多次实验的重现性一直都是一个难题。
黄博士当场演示了混合蛋白质的分离聚焦检测,以及让其扩散后通过测定扩散系数来计算分子量的实验。整个实验只做一次,得到各个蛋白的pI点和分子量,耗时不到1个小时,结果是非常令人震惊的!
CEInifinite已经可以实现和质谱联用,希望和客户进行高水平的合作,并且用激光诱导荧光检测技术进一步提高CEInfinite的灵敏度,可以预计,cIEF-WCID(全柱成像毛细管等电聚焦电泳仪)技术未来将对蛋白质组学、生物制药研发领域产生巨大的影响。
三、蛋白质分析研究和质控的利器:
纯度检测、质控、稳定性研究、蛋白定量、食品安全、植物生理学和功能性蛋白的监控、真伪鉴别
在生物制药行业运用CEInfinite,可方便地对蛋白质药物在贮存0-6月时,进行稳定性考查及其纯度测定,能够快速准确测定酸性/碱性降解蛋白的pI值;还可以应用于蛋白质药物主成分、以及酸性/碱性降解产物的 pI 点测定和纯度考察。
CEInfinite还可进行蛋白质和抗体药物的稳定性研究,这对于新药研发和质控有重要意义。比如研究Hb A0 溶液(10µmol/L)在37oC放置3天的稳定性,和蛋白质药物在酸性条件下(pH<7.0)的稳定性。
参考:蛋白质稳定性研究的应用
CEInfinite是蛋白质药物和抗体药物和工艺研究的强有力手段,能够表征不同的抗体药物和治疗性蛋白质药物的成分,为质控和工艺研究提供基础性研究数据。
黄博士讲到的CEInfinite在食品安全等领域的应用非常吸引人。他说:“三聚氰胺事件反映的是,国家标准中测定的是总氮含量,而不是原来 的蛋白质含量,这就给作假造成了可趁之机。很多蛋白产品(比如奶粉、婴幼儿奶粉、胶原蛋白)等的质控,用液相色谱法都很难,样品需酶解为多肽才能检测,这 样就又在分析中引入了新的化合物,而且检测的不是原来的蛋白质。
而用CEInfinite,可以快速、高分辨地、直接测定混合物中的蛋白质,包括pI点和分子量等多个参数,可以应用于特征蛋白质标志物的定性 定量监控,或获得多种蛋白混合物的指纹图谱。我们非常希望跟各位科学工作者合作,开发一些方法,为中国的食品安全、蛋白药物、功能性蛋白产品的质量控制和 安全做出贡献。
四、蛋白质和其它分子的相互作用研究
黄博士谈到该应用的前景也兴致盎然:“一谈到蛋白质和其它分子的相互作用,大家常会想到GE Healthcare的Biacore。”由于CEInfinite cIEF-WCID(全柱成像毛细管等电聚焦电泳仪)的高分辨率、快速分析等特点,可以实时地观察到蛋白质在分离柱内的各种动态的变化,实时观察蛋白质与其它分子结合的产生、变化、结束等 各个过程,在蛋白质和其它分子相互作用。许多科学家们也发表了大量文献,介绍用全柱成像毛细管等电聚焦技术来研究蛋白质和其它分子的相互作用。“未来我们 还将根据科学家关注的方向,发展更多的配套方法、软件等,来支持在蛋白质相互作用领域的各种创新性研究。非常欢迎各位应用科学家们给我们指出 CEInfinite更多的应用构想。”
这里,举例了一些可能的研究方法,如:利用CEInfinite动态检测蛋白质和抗体药物的聚焦过程,直接和动态监控生物大分子、蛋白质-药物之间的相互作用,从而研究其功能和活性机制。
比如:用CEInfinite研究Ab-Ag相互作用,其复合物能够被高分辨测定,相互作用能够被动态表征;研究人血红蛋白A0和顺铂类抗癌药物Cisplatin的相互作用;动态监测胰蛋白酶抑制剂–PC/PS(8:2,mol%) 的相互作用;研究Ca2+和磷酸化酶b的相互作用;动态研究蛋白质-DNA的相互作用及其复合物的形成。
参考: 蛋白质的生物相互作用研究的应用
绿绵科技的总经理欧阳伟民先生表示:“全柱成像毛细管电泳技术在中国市场将有非常广泛的应用。目前主要应用在生物药的质控,在蛋白质基础研究上也有广泛的应用前景,如细胞株的筛选、蛋白质构象、蛋白质与药物相互作用、蛋白质与金属离子相互作用、蛋白质之间相互作用等等。同时在食品中功能蛋白的分析也有非常大的市场潜力,绿绵科技也做了一些基础的实验,如肉类的掺假、奶制品的乳清蛋白和酪蛋白的分析、育种分析等。随着方法的进一步完善,将来 clEF-WCID(全柱成像毛细管等电聚焦电泳仪)在这些领域的应用潜力非常巨大。”
CEInifinite的独有技术
谈到CEInfinite的独门绝技,还得先谈谈黄铁民博士本人以及2010年成立的AES公司。
1997~2003年,黄博士在加拿大滑铁卢大学读研究生期间,便开始从事全柱成像毛细管等电聚焦电泳技术相关理论的研究工作,并获得了荧光检测和全柱检测的专利;并在2010年创办了AES公司(Advanced Electrophoresis Solutions Ltd )。
据黄博士介绍,早在10年前,他本人就参与编写了三部手册介绍cIEF-WCID(全柱成像毛细管等电聚焦电泳仪)技术,并前后发表了50余篇应用文章。
CEInifite发展了更多新的应用和技术,比如除pI测定外,还可进行蛋白质分子量的测定和蛋白质相互作用的研究;CEInfinite上可配置激光诱导荧光检测器,将具有更高的灵敏度。
在中国的发展
谈到在中国未来的发展,黄博士表示:“cIEF-WCID(全柱成像毛细管等电聚焦电泳仪)技术在中国将有很好的发展前景,近期相比欧美国家还将有发展优势,这与中国整体的经济 发展和科技发展的现状有关。近年来欧美经济的发展遇到了很大的困难,实验室没有很大的动力改变原有的检测方法体系;而中国很多方法都在新建中,更容易直接 采用新技术。如临床、食品和新药开发上的很多应用方法,中国都正在建立之中;而国外很多检测方法早已建立好,没有更多的动力去做新的方法。所以,现在有意 愿进行这些科研、并有经济能力和人才去使用新的cIEF-WCID技术的实验室更多将在中国。”
“如果我们更努力推广,与更多的实验室合作,使用cIEF-WCID(全柱成像毛细管等电聚焦电泳仪)技术建立的方法还有望成为一些新的标准,因为cIEF-WCID的显著特点 是高效、节能。如贫血时的验血,用cIEF-WCID五分钟就可以完成了,而高效液相需要一个小时才能完成。所以,一般的医院也可以高效、快速地验血了, 解决了一般人看病难的问题。”
“cIEF-WCID先进的技术会让研究者们发现很多传统技术发现不了的东西,将会促进中国的科研水平大幅提高。”黄博士自信地说,“两性载体 是上个世纪七八十年代在欧洲发展起来的,但是后来一直都没有成功应用到传统的毛细管电泳中,现在我们将两性载体的技术应用到更先进的CEInfinite cIEF-WCID仪器中,如果中国更快使用这种更先进的仪器,会在该领域更快地步入全球该领域的科技前沿。我本人当然非常愿意花更多的精力支持中国的发 展。”
clEF-WCID应用价值高,绿绵科技对此新技术充满信心
AES公司cIEF-WCID产品在中国的总代理、绿绵科技的欧阳伟民总经理表示:“绿绵科技一直关注行业先进技术的发展,致力于先进技术的传 播和推广,希望先进技术能更好的服务社会,全柱成像毛细管电泳技术(clEF-WCID)就是近几年来公司关注的创新技术。clEF-WCID的高效、快 速、高分辨能力为生物药物分析提供了新手段,同时,结合我们对行业的经验和对全柱成像毛细管电泳技术的了解,cIEF-WCID还可应用到食品安全、农业 育种、临床检验等领域。这些应用都将非常符合中国的发展需求,我们非常看重此技术的应用价值。”
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