质谱沙龙第十八期活动报道

　　2009年4月25日下午，质谱沙龙第十八期活动在解放军307医院实验楼举行。来自二炮总医院、AB公司、朝阳医院、空军总医院、清华大学医学院、中科院动物研究所、解放军307医院的各位专家、学生20余人。

　　第十八期质谱沙龙活动现场

　　307医院药物临床试验机构副主任 刘泽源博士

　　报告前，由307医院药物临床试验机构副主任刘泽源博士，向大家介绍了该院药学部临床药理研究室，创建于1980年，是全军首家成立的临床药理学科，也是全国最早建立临床药理学科单位之一;1986年，被国家卫生部批准为国家临床药理基地，是全军第一个国家级药理基地。

　　本网收录前沿Lab：解放军三零七医院药学部临床药理室

 

　　液相色谱梯度方法的开发及其在质谱定量技术中的应用

　　报告部分首先由第二炮兵总医院药剂科李鹏飞老师跟大家一起探讨了《液相色谱梯度方法的开发及其在质谱定量技术中的应用》。

　　第二炮兵总医院药剂科 李鹏飞老师

　　李鹏飞老师根据自己的工作经验指出，在实际质谱分析中，有时通过优化质谱参数、改善前处理方案还不能提高灵敏度，这时就需要采用液相色谱梯度方法，并优化合适的梯度，利用该方法也可以有效地利用液相分离复杂体系。

 

　　梯度洗脱的含义及特点

　　梯度洗脱又称为梯度淋洗或程序洗提，在液相色谱中流动相由几种不同极性的溶剂组成，通过改变流动相中各溶剂组成的比例改变流动相的极性，使样品中的所有组分可在最短时间内实现最佳分离。优点是单位时间的分离能力增加；检测灵敏度提高；使样品与溶剂前沿基线分离，降低基质干扰。

 

　　梯度的洗脱方式

　　常见的双元（或更多元）梯度洗脱具备高压梯度和低压梯度两种方式，前者利用双泵流速控制流动相溶剂的比例，准确率高且稳定，梯度延迟比较小，但通常由于购置时未配置脱气机，可能还会残留一些气泡，另外由于购置经费的限制，一般配置到两元，更多元数的购置成本就过高了；后者采用单泵方式，利用分流阀控制流动相比例，混合后再进行在线脱气，所以一般能消除气泡，另外通常可配置为4元，但相比高压梯度的缺点是：准确率低而且死体积比较大，梯度延迟比较严重。

 

　　梯度洗脱的可变参数

　　梯度曲线

　　如图中所示6号曲线称为等梯度，2、3、4、5号曲线为凸形曲线，7、8、9、10号曲线为凹形曲线，它们被称为非线性梯度。在有机相和水相固定的前提下，水相的强度不应太弱，有机相的强度不应太强，通过改变梯度的陡度及形状，可以对多组分的化合物进行有效地分离。梯度曲线下的面积越大，洗脱能力越强。

 

　　梯度洗脱步骤的建立及应用

　　为了使样品的混合组分有效的分离，掩盖住杂质峰的干扰，一个合理的梯度洗脱方法建立是十分关键的。首先确定好水相和有机相以及色谱柱，先采用等度的洗脱方式（即采用6号线）试验，看是否能达到理想的分离效果，如不理想则需要使用梯度洗脱方式。

　　如果谱图上接近 t₀ 处显现谱带挤在一起，则需要降低初始水相的强度；若谱带远离色谱图的开始部分，则应增大水相的强度。

　　如果需要洗脱很长时间，则应增加有机相的强度；反之所有的谱带都在比较靠前的位置被洗脱，则应降低其强度。

　　如有必要可以调节斜率，为增大灵敏度可以增加斜率，为增大分离度可降低斜率。解决具体问题，比如溶剂分层，没有有效的弱溶剂时，可以用梯度延迟来解决谱图前部分离度不佳的问题。

　　通过选择梯度曲线凸线或凹线形式，来达到理想的分离效果。当谱图中谱带聚集到一起要使它们分开时采用凹线(即7、8、9、10号线)；当遇到谱带分离太散时考虑采用凸线(即2、3、4、5号线)来缩短分离时间。同时还要考虑到梯度平衡时间以及有机污染物对梯度洗脱的影响。

　　接下来，李鹏飞老师例举了一个含有9个烷基苯酮化合物梯度方法的开发实例。利用上述的梯度洗脱方法的建立步骤，最终达到了理想的分离效果。

　　最后，李鹏飞老师简单地介绍了液相色谱分析中各种梯度洗脱方式是如何实现的。

      本网收录前沿Lab：第二炮兵总医院分析中心

　　报告下载： 《液相色谱梯度方法的开发及其在质谱定量技术中的应用》

 

　　华法令的质谱检测及相关药物基因组学研究

　　来自朝阳医院药剂科张征老师为大家介绍了《华法令的质谱检测及相关药物基因组学研究》的报告。

　　朝阳医院药剂科 张征老师

　　华法林/华法令是临床常用的口服抗凝药物，机理就是通过抑制凝血因子的活化从而抑制新的血栓形成。该药抗凝效果的指标是凝血酶原时间(PT)以及国际标准化比率(INR)。适应症包括肺栓塞、冠心病、瓣膜病、非瓣膜病性房颤和深静脉血栓。华法林也是第一代抗凝血杀鼠剂，是维生素K的竞争性拮抗剂。

　　华法林在临床上存在许多问题，例如个体差异比较大，不同病例的日口服剂量差别很大；治疗窗窄即国际标准化比率目标值需要达到2.0到3.0之间，才能保证出血风险降到最低，由于范围很窄所以调整剂量时间比较长，如果调整不好会带来很大的出血风险。

　　为了解决这些问题。临床上普遍采用药物基因组学的方法，简而言之就是利用基因组学的方法在一组人群里把具有特殊基因多态性的人群挑选出来，对他们改变剂量或使用其他药物，因为这类人群由于基因型存在显著的不同，造成服用同种药物或相同剂量的情况下无效或中毒。

　　华法林给药剂量与病人年龄、体重、种族、血浆维生素K水平、饮食、基因多态性等因素相关。

　　影响华法林代谢的基因有30多种，可分为药动学和药效学两类相关基因，经研究证实其中CYP2C9和VKORC1在基因因素里是最强的影响因子。

　　华法令结构式中具有一个手性C原子，形成一对对映体，S-对映体的体外抗凝活性为其R-对映体的6～8倍，体内抗凝活性为2～5倍，此差异可能的解释是S-对映体的蛋白结合率较R-对映体高。S-华法林在人体内主要进行7-羟化代谢，是由CYP2C9形成的;而R-华法林则主要进行6-羟化和酮基还原反应，是由于CYP3A4、 CYP1A1、 CYP1A2形成的。

　　由于这些影响因子的作用，2007年8月16日，美国FDA宣布批准了warfarin说明书的修改，强调CYP2C9和VKORC1基因变异导致35～50%的患者对华法林反应存在个体差异，需要更低的起始剂量。

　　最后张征老师简单地介绍了把华法林作为一种鼠药中毒物质所完成的质谱检测分析，列举了检测中质谱条件、色谱条件以及血浆样品前处理分析数据。条件简述如下：液-液萃取法，C18柱，负离子检测。实验结果为：血浆中华法令在0.40～200 ng·mL^-1浓度范围内与峰面积比线性良好，定量下限（LLOQ）为0.40 μg·mL^-1，其准确度和精密度符合要求 。

　　报告下载：《华法林的质谱检测及相关药物基因组学研究》

 

　　串联质谱在药物代谢中的应用

　　来自AB公司的张克荣工程师为大家介绍的报告内容是串联质谱在药物代谢中的应用。

　　AB公司 张克荣工程师

　　随着我国对创新药管理日益严格，加强对体内活性代谢产物及毒性代谢产物的鉴定是一个必然的发展趋势。

　　张工程师首先介绍了目前鉴定代谢产物的分析过程。一般是采用质谱技术分析空白样品和给药后的生物样本，比较得出他们之间的差异离子，对这些差异离子进一步进行结构解析初步确认代谢产物，制备该产物的对照品通过核磁共振确定其结构，比较对照品和代谢产物在质谱和液相分析中行为是否一致，从而最终确定其结构。

　　在分析仪器方面，采用三重四极杆质谱系统的中性丢失扫描和母离子扫描技术寻找代谢产物，通过全扫描灵敏度较高的离子阱质谱技术进一步确认，也可利用具备高分辨率的Q-TOF技术确定分子量信息。串联质谱和离子阱质谱技术可以完成80%的鉴定工作，Q-TOF质谱只占到5～10%的工作量。

　　AB公司推出的Qtrap型质谱系统结合了三重四极杆和离子阱技术，并提供多种扫描方式，在代谢物分析的实验中可以更好地帮助研究者开展工作。接下来张工具体介绍了Qtrap技术在鉴定药物代谢产物的分析流程。

　　首先在进行鉴定工作之前，要对药物代谢产物有一定的认识，药物进入人体后在酶的作用下将产生一相代谢物和二相代谢产物，在二相代谢产物中比较关注的比如带有毒性的谷胱甘肽产物。

　　二相代谢产物主要是结合体内一些内源性物质而产生的，其质谱特征很有规律，可以通过中性丢失扫描和母离子扫描技术来寻找。

       而一相代谢产物是由于氧化还原形成的，质谱特征不是很规律，情况比较复杂，除了采用中性丢失扫描和母离子扫描技术，有时还需要采用一级全扫描技术寻找可能的代谢产物，对于一些低含量的代谢产物还可以通过特异性较强的MRM方式进行筛查，比如：AB公司推出的pMRM技术。所谓pMRM可理解为“预见的MRM”，即从理论上预知各种形式代谢产物可能出现的离子对，再进行高灵敏度的MRM实验，该软件应用十分简单，在很大程度上降低了分析人员的工作量。

　　在以上工作流程的基础上，Qtrap系统还可以设置由MRM触发做二级全扫描，通过更丰富的碎片信息来确证代谢产物，并进行代谢产物的结构鉴定工作。AB的LightSight™Software2.0软件还可以自动分析出空白样品和给药后的生物样本的差异离子。

 

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