第二十五期质谱沙龙活动报道分析测试百科网wiki版

发布时间：2010-01-27 13:53 原文链接：第二十五期质谱沙龙活动报道

【导语】大气压下离子化技术曾获得2002年的Nobel化学奖，今日，它是否可以让我们跟溶剂、液相色谱、梯度条件这些词汇说拜拜，实现快速、实时、绿色的质谱分析？用LC-MS/MS方法测定全谱氨基酸，是否可以让我们更快速地检测患者的疑难杂症？双梯度液相会给我们带来什么好处？请关注下文详细报道……

　　2010年1月23日下午，2010年度第一期(总第二十五期)质谱沙龙活动在解放军第二炮兵总医院药剂科举行。参加本次活动的除了有来自中国食品工业发酵研究院、第二炮兵总医院、AB公司、军事医学科学院、中科院动物研究所、中科院过程工程所、协和医院的老朋友外，还有来自厦门大学、ASPEC华柏生物科技有限公司、戴安公司的新朋友。与往期不同的是，本期活动增加了液相色谱的内容。

　　第二十四期质谱沙龙活动现场

　　直接实时分析：升级你的LCMS

　　ASPEC华柏生物科技有限公司的首席技术官刘春胜博士

　　首先，ASPEC华柏生物科技有限公司的首席技术官刘春胜博士为大家带来了报告“直接实时分析(Direct Analysis in Real Time，DART®)：升级你的LCMS”。

　　为什么要升级你的LCMS?

　　刘博士以发问的方式开始了他的报告——为什么要升级你的LCMS?

　　LCMS接口技术经历了ESI、APCI、微/纳喷雾等历程，它的理念是快速、简单，至今已被广泛应用于多种应用领域。尽管LCMS具有可定性定量、选择性与专属性(分辨率和质谱精度)高、灵敏度高(可达pg甚至fg级)、响应范围宽、分析速度快、经久耐用、自动化程度高等优点；但也面临着以下挑战：

　　1)溶液状态可能使样本降解、发生反应；

　　2) 需要耗费时间和人力的样品制备过程；

　　3) 存在离子抑制效应，会降低检测降低灵敏度，比如ESI源中无机盐/非挥发性盐对样品信号的严重抑制；

　　4) 需要专家操作(人力成本高)、维护成本高(比如今日的乙睛价格非常高昂，而处理大量的废液也会使成本增加)；

　　5) 分析速度还不够快，通常的LCMS从接样到出结果约需3~4小时，但使用者希望几分钟就可以出结果。

　　明天的生物学对速度的要求，是希望几分钟就能出结果，从而实时地支持临床治疗；而绿色化学的要求，希望耗费小流量的溶剂甚至是——无需溶剂。那么，什么可以做到快速和绿色化学呢？答案是——DART® ！

　　DART的原理

　　DART®是一种非接触的表面采样技术，用于室温和大气压下的解析电离质谱，是一种“开放式的直接探针”。可以检测分析挥发性或不挥发材料，也可用于分析气体、液体、固体和材料表面。该技术是一种无损耗的分离、离子化和脱附技术，对环境要求不是很苛刻，适合车载和便携式现场检测。

　　DART®于2005年由JEOL(日本电子)和IonSense公司联合商品化，并获得了当年的匹兹堡金奖和R&D 100创新大奖。

　　DART®的结构示意图

　　DART®的原理是：载气（第一代DART®为氦气，价格较高；第二代为氮气，可以加热）被引入腔体，在3 ~ 5KV的放电针下产生等离子体，透镜将带电粒子转移，电极栅/气孔可以阻止离子与离子间的二次结合。出来的等离子体打在样品表面，和样品发生能量转移、质子转移、电子捕获等作用，从而产生样品离子后进入质谱，分析过程类似APCI源。整个过程没有暴露的高压，保证了安全性，且在室温下即可操作。使用者也可几分钟拆下自己的ESI源，换上DART。

　　DART的优点和用途

　　刘博士介绍，DART®的优点在于快速即时地离子化固体、液体和气体；无需样品制备；质量范围达2000Da；几乎可以和所有商品化的质谱联用。DART®使得质谱简化，对未知物的分析更容易。DART®不会形成钠、钾的加合物，离子信号更简单直接；DART®也不会产生多电荷离子，不存在离子抑制效应，即使对很脏的尿样也可以分析，即可以分析原型样本。DART®几乎可以和所有商品化的MS联用（除岛津的质谱），如DART®-Waters ZQ、DART®-Thermo LCQ、DART®-API 3000/4000 /100。在灵敏度方面，有人曾试验用DART®与API 3000连接，与API 4000做同一样本的灵敏度接近。

　　DART®目前有几种型号：

　　1) DART®100，这是最早期的DART®产品，具备最基础的DART®功能；

　　2) DART®-ET，该技术加大了样品分析的空间，满足样品量大和来源多样性的要求；

　　3) DART®SVP，该技术09年刚推出，是一种用iPOD touch操控的智能化技术，可以全面操控DART源的各种参数和分析过程；并可从网站下载各种参考方法、样品谱库，可适用于便携分析场合。

　　另外，DART®还可使用分析大量样品的Auto DART®-96、化学噪音更低的Dip-it®采样技术、可以捕获更多气化离子的Vapur®技术，其中Vapur专利技术，可以把DART产生的离子通过长距离的传输线传入质谱，并保证信号灵敏度，对于安检、法医、应急检测非常有用。

　　刘博士举例了DART®分析的多种应用，包括药品、代谢组学、爆炸物、有机合成和有机代谢、食品和饮品、毒性工业材料、杀虫剂、低聚糖、包装和聚合物，总之，除了蛋白质的所有物质均可用DART®分析（注：蛋白等可用DESI源，但DESI源目前尚没有成熟的商品化仪器）。与LC相比，DART®的条件更简单，过程控制更能反映真实情况。DART®最重要的特点就是可对LC无法分析的膏状物、糖浆以及尼龙样、胶水、粘合剂等高聚物进行分析，虽然裂解质谱也可以分析高聚物，但DART®对样本是没有损耗的。

　　DART®定性分析的原理与LC/MS相同，可以用Q-Trap、Orbit-Trap、FT分析，iTouch可下载的谱库中包含23,000个天然产物和800多个农残谱图。DART®也可用于定量分析，比如用氘代内标定量法，线性范围在3个9以上。在使用简单性方面，iTouch已充分地实现人性化，比如用红绿灯显示农残是否超标，这甚至使家庭主妇也可以方便地使用DART。

　　报告最后，刘博士总结到，DART®自2005年发明以来，DART®-MS作为一种崭新的质谱分析技术被广泛地应用于药物发现与开发、食品安全检测、司法鉴定、材料分析及相关化学和生物化学分析等领域。

　　相比于现行通用的LC-MS技术，DART®-MS分析将不再需要繁杂的样品制备技术和耗时的色谱分离。作为一种“绿色”分析检测技术，DART®-MS将急剧缩短样品分析周期，极大地减少对化学溶剂的消耗和对固定资产和人员的投资。

　　对于DART新型离子源技术，在座者均表示出浓厚的兴趣，和刘博士展开了热烈的讨论。

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　　人体LC-MS/MS全谱氨基酸检测技术及医院工作中的应用

　　解放军第二炮兵总医院药学部李鹏飞老师

　　解放军第二炮兵总医院药学部的李鹏飞老师为大家带来了报告“人体LC-MS/MS全谱氨基酸检测技术及医院工作中的应用”。李老师首先举了一位患者氨基酸检测的实例，来阐明他们检测观念的转变——从以检测技术为核心转变为以患者为核心，即从为了追求更好的数据转而为满足患者的需求进行检测。

　　接下来，李老师介绍了下列几个方面的内容：

　　一、研究背景与氨基酸检测的意义

　　人体内包含很多氨基酸，重要的有40余种，我们称之为全谱氨基酸(The Full Spectrum of Amino Acids)。全谱氨基酸在体内是一个动态的平衡。这一平衡打破，是很多疾病的诱因或表现形式。

　　目前，氨基酸代谢障碍所引起的疾病已超过100多种，称作氨基酸代谢病。氨基酸代谢病即氨基酸病，或称为氨基酸尿症(aminoaciduria)。

　　李老师从两方面总结了氨基酸与疾病的关系。一方面，如果患者患有某种疾病，某些氨基酸升高，通过检测氨基酸水平就可以表示这种疾病，那么这类氨基酸就可作为该疾病的生物标记物，也可进一步建立疾病诊断的标准;另一方面，如果氨基酸是疾病的诱因，氨基酸的升高或降低导致了疾病的产生，那么可以这几种氨基酸为切入点，进行治疗。

　　目前，主流的氨基酸检测方法有以下几种：

　　1) 自动氨基酸分析仪：该方法检测灵敏度低，检测种类有限，但检测成本低、方法固定;

　　2) HPLC：灵敏度较高，但对于同分异构氨基酸和痕量氨基酸分离效果不是很好;

　　3) 串联质谱仪(LC-MS/MS)：这是一项比较新的检测技术，具有检测范围宽、精确定量(独立的同位素内标)、速度快(25分钟分析一个样本、可以分析复杂样本(血液、土壤、蛋白水解液)的特点。

　　二、全谱氨基酸检测与分析系统的开发

　　李老师介绍，全谱氨基酸的检测和分析借鉴了“同位素标记的蛋白质组定量方法”，选用内标法。具体的原理，可参见：质谱沙龙第十三期报道之——人体内45种氨基酸定量检测和肠内外营养

　　和第七期报道之——准确的定量和快速筛查方法：用LC/MS/MS做临床氨基酸测定

　　本次报告报道的氨基酸样品前处理和分析流程如下图所示：

氨基酸样本前处理流程

　　实验结果表明：

　　1. 总离子流谱图中有80多个色谱峰，同时定量了40多个氨基酸。通常一个分析时间25min，出峰完全是12min，之后是梯度再平衡。结果表明：分辨率较高，可以实现较好的分离。

　　2. 内标定量结果表明了定量的原理，从图中可以看到，每个氨基酸均对应于内标，因此谱峰是一对一对出现的，由于只是同位素的差异，而同位素差异对前处理行为、色谱行为和离子化行为没有影响，这样就可以通过质谱行为的差异区分两个峰，通过已知浓度定量未知浓度。本方法中采用的是114标定标准品，115标定样品。

　　3. 高分离度结果：通过使用很平缓的高取向柱子做一个长梯度，最后做一个循环来做到高分辨。

　　4. 从工作站自动生成的单个氨基酸图谱报告中看到，对每个氨基酸均可得到一个对应样本谱峰、内标谱峰以及最终的准确的浓度信息。

　　这部分的最后，李老师总结了引进的串联质谱检测全谱氨基酸方法的优势：1) 高通量，25min即可检测一个样本;2)每个氨基酸都有自己的独立同位素内标，可以精确定量，严格区分同分异构体，灵敏度大pmol级;3)能够同时分析复杂基质中42个氨基酸，为临床、科研、保健品和药品开发提供全面信息。

　　三、临床应用及课题拓展

　　本部分李老师讲解了在引进方法的基础上进行的拓展——全谱氨基酸代谢组学分析系统。该系统可以给出比较直观的检测报告，不仅检测结果一目了然，还可以归纳出出一些结论。检测的氨基酸为42种，系统按照生理机能等因素将结果分为以下五大类：必需氨基酸-10种、神经内分泌相关、氨能量代谢相关、硫代谢相关、附加代谢物。

　　此外，系统还可给出分析报告，包括：

　　1)单个氨基酸分析，对每个结果异常的检测项都做了详细的解释。包括参考上下限、基本介绍、营养健康评估、营养补充调节建议、营养干预因子、体内详细代谢图谱。

　　2)多指标/特殊指标分析，氨基酸在体内是一个动态的平衡体系，很多氨基酸是相互关联的，通过对相关氨基酸的数据分析，可以得到更多的信息。

　　3)适合普通体检的健康分析，从十三个健康系统中选择与某一健康系统相关的氨基酸，对其进行权重加和，以正态分布为参考，考察体检者该健康体系的状态。

　　4)干预调节，这是软件自动生成的一种干预，系统对代谢紊乱的受检者提供2项干预指导，一是必需氨基酸的补充建议，另一是常见的药物干扰。

　　5)医师、营养师建议。

　　最后，李老师对全谱氨基酸检测进行了展望。李老师还将进行“全谱氨基酸检测技术指导肾病干预试验”和“LC-MS/MS全谱氨基酸检测技术指导建立糖尿病风险筛查模型及初步的营养学评价”方面的研究。围绕《全谱氨基酸代谢组学分析系统》开展临床检测，全面深入开展临床服务;寻找新的生物标志物，开展临床验证，建立LC-MS/MS法诊断标准;探索氨基酸检测在军事领域的应用，为军事医学服务;全方位开展对外检测报务。其中，通过氨基酸水平评价亚健康状态和区域性疾病正在申报课题。

　　报告下载：人体LC-MSMS全谱氨基酸检测技术及医院工作中的应用

　　本网收录前沿Lab：第二炮兵总医院分析中心

　　戴安公司双梯度液相色谱及其应用

　　戴安公司液相色谱应用工程师赵秀苔老师

　　戴安公司的液相色谱应用工程师赵秀苔老师向大家介绍了“戴安公司双梯度液相色谱及其应用”。赵老师介绍，戴安公司拥有从纳升级液相色谱、常规液相色谱到半制备级液相色谱全面的高效液相色谱级别。此外，戴安公司还生产常规、超高效、生化液相色谱柱。智能化的液相色谱有变色龙色谱网络软件支持，可控制大约30 个生产厂家的近300 种的色谱部件。

　　戴安公司的UltiMate3000系列液相色谱有紧凑系统、标准系统、钛系统、超高速液相色谱(RSLC)、x2双梯度液相色谱系统(DGLC)。其中，赵老师主要介绍了DGLC。DGLC的模块及其功能如下图所示。

　　DGLC模块及功能

　　DGLC有不同的配置可供用户选择，如微流速系统DGP3600M和超高效(U-HPLC)双梯度液相色谱系统DGP3600RS等。DGLC可以为用户解决以下问题：

　　1) 快速分析：即在不改变已经经过认证的方法的前提下，提高分析速度。包括节省梯度平衡的冲洗时间、提高梯度方法的速度的串联(Tandem)色谱以及对任何方法都能通过共享色谱泵、自动进样器和柱温箱来提高一倍分析速度的并联(Parallel)色谱。

　　2) 不同应用之间的快速切换：一台仪器同时为两种应用做准备，连续不间断运行两个不同应用。

　　3) 多维分离：即通过2D 或3D 提高分离度，多用于生化及蛋白质组学领域，目前主要集中在微柱、毛细管柱及纳升柱，也包括今年流行的“全自动离线”多维色谱。

　　4) 样品的在线(On-Line)前处理：集成的SPE 小柱可提高自动化程度，还可以直接分析血样、食品样等较脏的样品。

　　5) 提高质谱灵敏度：体现在在线快速脱盐、使用左泵作为辅助泵以及通过柱后交换流动相增加挥发性有机溶剂比例、调节pH值、或添加辅助试剂以提高质谱的响应值。

　　6) 柱后衍生;将第二个泵作为柱后衍生泵。

　　7) 兼容性：可兼容任何现有的HPLC 系统。

　　接下来，赵老师戴安公司的几种智能化质谱解决方案：

　　1. 串联液相色谱

　　串联液相有两个流路，色谱柱在两个流路间切换，即再平衡过程中直接用柱切换阀切换至图中左面的泵进行再平衡和清洗，在运行周期中省去了冲洗及平衡色谱柱的时间。

　　2. 并联液相色谱

　　并联液相相当于两套独立的流路，共享一个自动进样器和柱温箱。并联液相通过变色龙软件将其配置为两套系统，可运行不同应用程序下的两套样品。

　　为了进一步说明上述解决方案的特点，赵老师举了环境中爆炸物残留的分析的应用实例。

　　爆炸残留物的分析在军事演习现场及周围环境评价、犯罪及恐怖袭击案件的侦破中都有重要的意义。EPAMethod8330是检测环境中爆炸残留物最常用的方法，该方法中规定了14种需要监测的爆炸物，建议用一种色谱柱(如：C18柱)作为主要的分析柱分离这些化合物;并建议用另外一种选择性有差异的反相柱作为补充确认(如：CN柱)。14种化合物都要被分离(而2006年新的8330B需要分析多达17种)，并在分析后尽可能快地确认。用普通C18及CN很难满足上述要求。Dionex的专用色谱柱(Acclaim Explosive E1 及E2 色谱柱)可以一次分离全部14 个所要求的物质。E1 及E2 有不同的选择性。如果用并联液相色谱系统，可用E1 分析、E2 确认，大大提高了检测通量。

　　3. 两维色谱(2D色谱)

　　2D色谱结合使用两种不同选择性的色谱柱，极大程度地提高了峰容量和分离选择性。2D色谱有在线(on-line)和离线(off-line)两种。

　　off-line 2D色谱是一种可以极大提高复杂混合物分离度的简单、快速的方式。此方法最具优势的地方是一维和二维之有浓缩富集的应用。此方法不适合定量分析，但是，如果样品的热稳定性好，提高自动进样器温度使流动相挥干再定容就可以克服这一点。用变色龙软件可编辑自动进样器程序。

　　on-line 2D色谱适宜应用于简单体系，它提供一个快速、方便的常规不纯物的分析。密闭体系，避免样品丢失以及降解，可用于定量分析。

　　4. 在线固相萃取/ 浓缩(On-Line SPE)技术

　　On-Line SPE技术具有以下特点：减低手工操作需求、节约时间;重现性高;方便于直接进样;更快、更经济;可以自动化;无人照管操作过夜或过周末;减少接触对人体有害物质的机会。该技术广泛应用于食品及饮料分析实验室、环保实验室和制药及临床实验室。On-Line SPE检测方法可借助变色龙软件进行开发。