qPCR过程中有关RNA的问题

一、RNA 抽提注意点

！要避免RNase 污染

１需使用DEPC或高温高压处理耗材、器皿、试剂

２要求控制标本量：如组织：约40~100mg/ml TRIzol;

细胞：106~107细胞/ml TRIzol

３严格按照RNA抽提步骤进行，如戴手套、口罩操作实验

４如检测miRNA，必须含小分子RNA 

 二、RNA质量

 1、RNA检测---采用甲醛变性胶 

理论上28S:18S = 2.7:1 即为高质量的RNA

 2、分光光度法检测

 3、1.7 ＜A260 /A280 < 2.0------------基本无污染

         A260 /A280 <1.6------------蛋白或有机相污染

   解决：

   a.确保不要吸入中间层及有机相

   b.减少起始样品量，确保裂解完全

   c. 加氯仿重新再抽提、纯化

 4、A260 /A230 比值低-------试剂残留（乙醇）、多糖类污染

　解决:

    a. 加氯仿重新再抽提、纯化

    b. 风干RNA沉淀前去尽乙醇