ribC持续进化提高黄素单核苷酸全细胞催化合成

　　江南生物工程学院饶志明教授团队在全细胞催化合成黄素单核苷酸方面取得重要进展，研究成果“Direct evolution of riboflavin kinase significantly enhance flavin mononucleotide synthesis by design and optimization of flavin mononucleotide riboswitch”正式发表于Bioresource Technology (https://doi.org/10.1016/j.biortech.2023.128774)。

　　黄素单核苷酸（FMN）是核黄素的活性形式之一，是一些辅酶、玫瑰黄素等的生物合成前体，这些辅酶在多种关键的生理功能中发挥着重要的作用。近年来，由于FMN在生命活动与健康方面的重要价值，其被广泛运用于医药、食品加工、饲料等领域中。

　　该研究首先对来源于Bacillus subtilis168的FMN核糖开关进行设计，基于核黄素操纵子5′-UTR能够受到FMN浓度变化影响从而改变自身构象的特性，构建了FMN生物传感器，并结合荧光蛋白对该传感器的功能进行了验证，结果发现野生型核糖开关响应FMN浓度范围区间较窄。因此，对核糖开关适配体与FMN非共价结合的位点进行研究，在J6/1位点进行突变，构建了饱和突变文库，并利用流式细胞仪进行高通量筛选，发现G5突变株荧光范围相较于野生型提高了127%，并基于此构建FMN生物传感器。接着，结合碱基编辑器TRACE系统，对来源于B. subtilis168的ribC基因进行体内持续进化，利用流式细胞进行高通量分选，初步筛选出1000株潜在的突变株，使用96孔板复筛，最终筛选出5株可能的有益突变株。酶活测定发现，相较于野生型，这5株突变株的酶活均有明显的提高。最终，在摇瓶中对突变株进行了全细胞催化实验，发现FMN的最高产量达到43.7 mg·L-1，摩尔转化率达到18.3%，产量提高至野生型的7.86倍，该研究构建的高通量筛选平台能够在大量、生理多样性的突变文库中筛选出正突变表型，为快速筛选工业化菌株提供了一个新途径。