质谱沙龙第三十期活动报道

　　2011年3月27日，第三十期质谱沙龙活动在第二炮兵总医院药学部成功举行。来自第二炮兵总医院、空军总医院、解放军第309医院、北京安贞医院、北京大学医学部AB SCIEX公司、天津博纳艾杰尔科技有限公司、北京艾米诺医学研究有限公司、美东生物(AOBO)公司等二十余位专家、学者、技术工程师等参加了本次沙龙活动。

第三十期质谱沙龙活动现场

质谱沙龙回顾及展望、LC-MS/MS定量分析中的几个问题探讨

　　解放军第二炮兵总医院李鹏飞老师主持沙龙活动并作了题为《质谱沙龙回顾及展望、LC-MS/MS定量分析中的几个问题探讨》报告，首先回顾了质谱沙龙活动三年多来所开展的工作，规划了今年的活动安排，展望了质谱沙龙的美好前景;而后，李老师重点介绍了他在分析研究中遇到的几个问题，与大家一起分享、讨论了他的做法和见解。

解放军第二炮兵总医院 李鹏飞 老师

　　质谱沙龙活动回顾与展望

　　质谱沙龙活动自2007年9月发起，由第二炮兵总医院药学部主办，北京师范大学分析测试中心、AB SCIEX公司、艾米诺医学研究有限公司等协办。沙龙的宗旨是构建有机质谱一线使用人员交流平台，坚持无偿公益的原则。质谱沙龙活动主要以专题报告和实际问题自由交流的形式为主，29期的百余篇专题报告以小分子化合物、大分子蛋白、中药单体/组方等为研究对象，介绍了药物研发、临床药代、食品安全、中毒监测等应用方向及其LC/MS新技术、新方法等。

　　2011年度质谱沙龙规划与展望：计划5期质谱沙龙活动，每两月举行一次;小分子定量质谱实验室多中心室间质评;从四本有关质谱及其应用的英文书籍中选择一本进行翻译;6月中旬举办第二届质谱沙龙联谊会;推出沙龙总结及专家团队介绍彩页，加强宣传和交流;进一步完善管理团队、专家团队、一线报告团队和组织团队，加强管理、走向正规。希望更多的朋友能参与进来，提供更高、更好、更贴近实际的报告，集思广益，把质谱沙龙建成一个更自由、更活跃、更高层次的交流平台。

　　LC-MS/MS定量分析中的几个问题探讨

　　李老师首先讲了雷奈酸和雷奈酸锶的问题。雷奈酸锶是治疗骨质疏松的一个药物，主要是锶在起作用，雷奈酸和锶结合后容易进入到人体内。对于雷奈酸和雷奈酸锶，临床药代实验都是要做的，锶建议采用无机质谱做，如ICP-MS等，雷奈酸用液质做。经过前期实验，李老师发现不管是正离子扫描还是负离子扫描，在预定的位置都没有出峰，添加离子化试剂，也没有峰出现。雷奈酸有四个羧基，有个氰基，还有个硫，按道理应该有峰出现，为什么就没有质谱峰出现?后来李老师通过原创方法，优化色谱条件，得到一个比较漂亮的谱图。分析验证，能够满足临床药代的需求。李老师说这个问题是想告诉大家，当用常规质谱方法不能奏效时，就要换个思路，如试试气质、液相、荧光、衍生化等方法。

　　锶是无机元素，在环境中肯定会存在，在体内也会存在。在空白和本底里都有锶的存的，那么测完之后的评价就是一个难题，要用空白添加法的话，标准曲线就没办法做。给完药后不同时间点测的结果减掉零点空白合适吗?我给药后可能采样持续一周，这中间吃饭也可能有锶进入体内，这时锶的浓度可能就会升高，都是有影响的。李老师查了这方面的相关文献报道，一些老师做的钾、钠等，同样有这个问题。减这个点到底怎样减，是减空白值，还是减平衡值，拿平衡值减甚至可能减出负数来，还有坐标曲线都不好做。是用空白点去做，还是用溶液的曲线去做，或是先拿溶液把量定出来，再加上空白等等，这些都和常规的药代是有区别的，我提出这个问题供大家来讨论。我采用空白添加法做这个曲线，然后用这个曲线的响应值减去空白曲线的响应值，得到的曲线完全就是加进去药的曲线，实际样本测出来后，对应的点单减去空白。不同的人有不同的做法，这本身就是一个很争议的问题。

　　接着，李老师又讲了一个氯吡格雷的问题。氯吡格雷是一种前体药，氯吡格雷经氧化生成2-氧基-氯吡格雷，继水解形成活性代谢物(一种硫醇衍生物)，约占约15%左右;另外还有一种非活性代谢物羧酸盐衍生物，约占85%，剩下的氯吡格雷1%左右。对三个对照品都做是最好的，其中氯吡格雷和羧酸盐衍生物比较容易检测，故筛选其中两个去做。当给药是75mg时，体内羧酸盐衍生物是3000ng;当给药是150mg时，体内氯吡格雷是2ng，两者悬殊3000倍。高通量质谱可以同时做，但有点勉强，最后选择了分开做。高浓度稀释后做，非活性浓度特别高，采用一个短柱做，六七百个药物两三天就做完了;浓度低用梯度方法做，而且响应值也做的很好，这样既不用很勉强去做，也能很快做完。

　　最后，李老师介绍了免疫抑制剂环孢素A。环孢素A是临床移植等用的药物，这种药物需要现场监测，因为它用药范围非常窄，高点或低点都会有问题，低了免疫性能丢失。采用博纳艾杰尔的蛋白沉淀板，是个很简便的方法，将样品上到板上，然后给一个涡流负压抽过去，就可以直接上质谱检测了。李老师分别对HPLC-MS/MS法和TDx分析方法测定全血中环孢素A及MAS沉淀板与蛋白沉淀质谱法测定全血中环孢素A进行了比较。最后得出的结果比较：HPLC-MS/MS法约是TDx的55%，MAS沉淀板法稍微比蛋白沉淀质谱法高7～8%左右，不论哪种方法都有稳定的比值。

I期临床实验室简介及工作中的问题探讨

　　北京安贞医院药物临床试验机构李静老师作了题为《I期临床实验室简介及工作中的问题探讨》的报告，介绍了I期临床实验室的相关情况，与大家一起探讨了在工作中如何解决基质效应问题、污染问题等。

北京安贞医院药物临床试验机构 李静 老师

　　I期临床实验室简介

　　药物临床试验机构于2006年9月12日通过国家药监局的资格认定，I期临床实验室简介设有精密仪器室、实验准备室(样品处理室)、离心机室等。实验室有Agilent 1100高效液相色谱仪、3200 QTRAP质谱仪、WaterPro PS/HPLC纯水器、Sigma 低温高速/低温低速离心机、精密电子天平、低温冰箱等主要一起设备，并配有Agilent 固相萃取仪、氮气吹干仪、奥利龙pH计、恒温培养振荡器和精密加样器等小型配套仪器，还有DAS、WinNonlin、SPSS、SAS等数据处理工具。

　　解决基质效应问题

　　关于基质效应的问题，李老师以新型二氢吡啶类钙通道阻滞剂为例，该类化合物化学性质不稳定，见光易分解。实验时加入尼莫地平为内标，样品前处理用蛋白沉淀法，采用ESI源质谱和Agilent Extend-C18色谱柱。上述条件方法考察5天，准确度与精密度、稳定性等考核均符合要求;15天后临床生物样本采集完毕，开始测定后发现测定完一批生物样本后质控样本测定不合格，被测物和内标响应均降低。

　　那该怎样克服基质效应的影响?一般方法是：改变被测物的色谱分离条件;选择合适的样品预处理方法，考虑沉淀蛋白法虽提取药物效率高，但同时也引入很多看不见的杂质，故样本前处理改用液液萃取法;稳定同位素内标;采用小样进量，约为10µl;利用液相色谱电解质效用。

　　解决污染问题

　　接下来，李老师向大家介绍了实验中应如何避免污染问题及注意事项。样品处理过程中怎样避免工作液配制污染，氮吹仪、加样枪头及加样过程引入的污染?注意操作台面清洁，手套污染及时更换或勤洗手;氮吹仪吹干时尽量不要让针孔伸到溶液液面之下，气流缓慢增大;加样时要从低浓度向高浓度操作。样品测定过程中怎样避免洗针液、流动相和进样器六通阀的污染?及时清洗试剂瓶，更换新溶液;规范洗针程序。接着，李老师又谈到了实验中要注意的几个事项：精密仪器日常维护(机器除尘、控制室内温湿度、气体供应是否充足、更换泵油等)，仪器定期进行校准检验，咨询专业人士和详细记录遇到的问题等。

　　最后，李老师提出了生物样本存储时间，生物样本储存期满后的处理方式，脉冲梯度色谱技术和液相色谱电解质效应等四个问题，供大家讨论。

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血斑(DRIED BLOOD SPOT,DBS)LC-MS/MS分析进展

　　AB SCIEX公司市场研究部经理彭立新博士作了题为《血斑(DRTED BLOOD SPOT,DBS)LC-MS/MS分析的进展》的报告，介绍了DBS分析的基础知识、优缺点，以及DBS液质分析法在生物医药领域的应用实例。

AB SCIEX公司市场研究部经理 彭立新 博士

　　血斑分析在40年前就已经存在了，最早用于临床实验，不需要精确的定量分析，现在主要用于新生儿和一些免疫系统缺陷疾病的筛查。

　　DBS技术分析特点

　　DBS分析的优点：操作方便，样品体积小，降低样品运输和存储成本。更重要的是能在临床前期实验中减少动物用量，这是医药公司尤其看重的。另外，采血量少，病人更容易接受，特别适合儿科。样品不需冷冻，稳定性好。

　　DBS分析也存在局限性，由于样品容量小，需要检测技术灵敏度高;同时，手工操作，工作量大，这两点制约了DBS分析方法的发展。这就需要液相色谱、质谱来助航。

　　血斑的LC-MS/MS分析

　　液质联用的出现，提高了血斑分析的灵敏度，可进行定量分析，误差小于15%，使血斑分析越来越来越热门。

　　AB SCIEX QTRAP 5500 LC/MS/MS系统是目前世界上最高性能的高端液质联用串联质谱系列。5500本身就能满足DBS检测灵敏度的需要， QTRAP 5500 能进一步消除基质效应。与Turbo V™离子源和MultiQuant软件连用可进行批量分析。另外，API 500和三重四极杆5500也完全能满足DBS分析要求的ng/ml级灵敏度。

　　使用QTRAP5500系统和先进的MultiQuant分析软件，LC-MS/MS分析方法速度快、灵敏度高，在DBS分析领域迅速发展，在布德松和氟替卡松丙盐酸测量方面取得了很大进展。选择不同纸板，增加血片直径等方法，可以提高样品容量。随着色谱、质谱等仪器和DBS技术本身的不断发展，不仅只可以做血斑还可以用于类似体液类样品的定量分析。彭老师通过几个实例详细介绍了不同样品的定量分析，如使用5500 LC/MS/MS，采用DBS方法可以定量分析氟康唑，采用DMS方法可定量分析眼泪中的妥布拉霉素等。

　　最后，彭老师总结说：DBS技术的准确度和精度能够满足做生化分析的要求，另外它是现在生化样品分析工具的一个补充，最重要的是它可以节省很多样品制备的费用。据预测，DBS技术未来将占据25%～50%的市场份额，随着质谱技术和DBS接口的技术越来越成熟，将会有更大的发展前途。

“二分五性三码一谱”新策略探索解决体内药物分析中存在的或然问题

　　空军总医院药学部的梁贵健老师作了题为《“二分五性三码一谱”新策略探索解决体内药物分析中存在的或然问题》的报告，分别从提出的背景、内涵意义和作用、实例等方面介绍了“二分五性三码一谱”新策略在解决体内药物分析中存在的或然性方面的探索。

空军总医院药学部的 梁贵健 老师

　　药物色谱分析方法现状

　　色谱分离条件的优化是色谱分析应用中面临的主要问题，分子结构参数与其保留值的预测一直是色谱学家追求的目标。尽管国内外在上述领域做了大量工作，但面对结构复杂多样的药物，其应用结果却大多难以令人接受。

　　目前建立药物色谱分析方法仍处于反复摸索的偶然或然状态，或借助单纯形、窗口图法、重叠分辨率法和均匀设计等优化方法。与其紧密相关的基础性问题，至今未得到系统的研究。

　　在生物样品分析中，如何避开内源物、临床联合用药和代谢产物对被测物的干扰，对于选择良好的色谱条件、预处理条件和优化内标物至关重要。要解决这样的问题，必须全面掌握内源性物质和常用药物的色谱行为以及预处理后被除去、纯化和富集的数据和规律。目前在这一领域的研究多为“就药测药”的应用性研究，还没有一个基于实验数值型数据库或能对流动相组成、内标选择和样品预处理方法三者进行推荐和仿真模拟的专家系统。

　　“二分五性三码一谱”

　　“二分”从分析样品性质上区分是药品分析还是生物药物分析，从药物结构上分清被测药物的酸碱性。“五性”即色谱性、检测性(响应性)、稳定性、回收性和商品性。“三码”即色谱码、检测码和回收码。“一谱”即内源性干扰三维码。二分定原则，五行选药物，三码找方法，一谱除干扰。

　　以HPLC-PDA-MS为测试手段，通过统一规范操作和计算机信息技术，创建高具有可比性的百种药物的色谱码、检测码和人血样品预处理回收码及去内源性干扰三维谱数据库，开创在网络上进行在线或离线指导快速建立稳健的HPLC药物分析方法的先例，解决流动相、内标和预处理三项试验方法优化的或然性瓶颈问题。

　　几个重要问题

　　梁老师还就实验中遇到的几个重要问题与大家进行了交流。

　　首先是内标，通过测试发现了一些光谱吸收区域宽、色谱行为优良和稳定性好的药物，有望充当常用内标物。并且通过实验总结出了20多种内标选择规则。接下来从内标的加入程序、内标被测物的相容性、内标来源和方法等方面进一步阐述了建立可推广的内标选择方法。

　　其次简单介绍了pH值4-5双突跃现象、在测量pH值时如何尽量减少误差，以及关于回收率的问题。

　　最后，梁老师对“二分五性三码一谱”新策略目前取得的成果和存在的问题进行了总结。