生物样品分析方法中基质效应的考察

LC/MSMS用于生物样品检测具有很高的灵敏度和选择性，但生物样品的基质干扰很大，基质组分有可能会干扰待测组分的质谱离子化效率，产生离子增强或抑制效应。使用MRM模式检测的时候，色谱图并不能反映出基质干扰对待测组分检测的影响，因此优化色谱条件时，通过直观的色谱图并不能很好地考察到基质效应的影响，如果分析方法建立的时候没有很好地考察基质效应，会对后续分析方法的重现性、线性范围和耐受的样品量都会有很大影响。

1.基质效应的评价方法：

文献中评价基质效应的方法主要有两种：

（1）空白基质处理后添加待测成分(post—extracted addition) ：这种方法是在经前处理的空白样品基质中添加待测成分，与用流动相配制的等浓度的待测成分纯溶液在相同色谱条件下分别进样，两者响应信号的比值，即可得到待测成分在该分析条件下的基质效应大小 。其计算公式如下：

ME=A/B*100%

A ： 在经过前处理的空白样品基质中添加已知浓度待测成分的响应； B：等浓度待测成分纯溶液的响应。

（2）柱后输注待测成分(post—column infusion )：这种方法是进样经前处理的空白基质样品时，在色谱柱之后、质谱离子源之前用一恒流泵输注适当浓度的待测成分溶液，与柱后的流出液混合后进入质谱。这样可以很直观地动态观察在整个色谱分析过程中基质对待测成分响应的影响。该法的优点是可以方便地考察评价不同样品处理方法，流动相添加物对响应的影响， 同时更有利于调整流动相洗脱程序和选择合适的色谱柱。

2方法学验证指导原则中基质效应的考察:

2015版中国药典9012原则里对采用质谱方法时是需要考察基质效应的。要求使用至少6批来自不同供体的空白基质,不应使用合并的基质。如果基质难以获得,则使用少于6批基质,但应该说明理由。

药典中建议使用的是对于每批基质,应该通过计算基质存在下的峰面积(由空白基质提取后加入分析物和内标测得)，与不含基质的相应峰面积(分析物和内标的纯溶液)比值，计算每一分析物和内标的基质因子。进一步通过分析物的基质因子除以内标的基质因子，计算经内标归一化的基质因子。从6批基质计算的内标归一化的基质因子的变异系数不得大于15%。该测定应分别在低浓度和高浓度下进行。

ME=(A/B)/(AIS/BIS)*100%

A :在经过前处理的空白样品基质中添加已知浓度待测成分的响应；B:等浓度待测成分纯溶液的响应;IS:内标

除正常基质外,还应关注其他样品的基质效应,例如溶血的或高血脂的血浆样品等。

3 减少基质效应的方法

（1）.优化前处理方法和改善色谱分离条件：

由于基质效应的产生是由与待测成分同时进入离子源的基质成分造成的，因此通过改进样品的前处理过程，尽量除去样品中的基质干扰成分，可显著地降低基质效应。使用液液萃取、固相萃取等前处理方式会比蛋白沉淀方式更能降低基质效应。

采用合适的色谱分离技术，使待测成分与基质干扰组分分离，避免干扰组分与待测组分同时进入离子源，也能有效地减少基质效应的影响。一般来说，使待测成分峰后移，可以有效地避免在溶剂前沿洗脱的极性基质成分的影响。但同时应考虑色谱峰后延可能会使待测组分峰展宽及灵敏度下降。

（2）.适当添加改性剂来增强待测组分的响应或抑制基质组分的响应：

适当地添加些改性剂可以提高待测物的响应，如甲酸、乙酸、甲酸铵和乙酸铵等，同时也可以改善色谱峰形。

（3）.降低流速来提高离子化效率：

使用较低流速，在LC／MS 中，尤其在ESI模式中，流速大意味着同时进入离子源的化合物也增多。需要同时离子化的化合物增多，加剧了待测成分与基质成分在电离过程的竞争，从而使待测成分的响应降低。此外，在低流速下可产生较细的雾滴，而使雾滴的总表面积增加，待测成分与基质成分在表面积的竞争减少，从而有利于产生气相离子，提高待测成分的信号强度。

和其他质谱离子源不同，ESI的表观行为有如浓度型检测器，其响应与流动相中待测成分的浓度成正 比。在流速较高的情况下，采用柱后分流，可减少进入ESI离子源的流量、降低基质效应、提高待测成分的信号强度和仪器灵敏度.

（4）.选择合适的内标：

内标一般选用与待测成分结构相似、性质相近的化合物。其中，稳定同位素标记物是最理想的选择，因为其可以模拟待测成分的提取和色谱、质谱行为，和待测成分有一致的保留时间，受基质成分的影响也极为相似，但待测成分与其同位素标记物在提取行为上也有可能产生极大的差异。另外，使用同位素标记物为内标需阐明存在的同位素纯度、避免待测成分和内标的MS／MS监测通道间的“ 交叉干扰”以及同位素稳定性(同位素交换现象)等问题。而选择同位素标记物作为内标的另一个缺点就是其合成比较困难，因而价格昂贵、难以获得。当难以获得同位素标记物为内标时，可以选用待测成分的结构类似物作为第二选择，2015版药典中考察的是内标归一化后的基质效应。