亚细胞构造的离心分离典型实验
一）简介：用简易的差分离心结合各种型式的密度梯度离心可以分离和纯化各种亚细胞器。研究者也可以根据自己的设备情况对实验参数做一定的改动，也可以更多地利用速率-区带密度梯度离心或等密度离心来简化实验过程和提高分离纯度。二）实验：ⅰ）匀浆制备： 鼠肝12克加入0.25M蔗糖与5mM Tris-HCL(PH7.4)共45ml用“概论”中建议的匀浆设备与方法制备成匀浆待用。ⅱ）实验流程： 鼠肝匀浆的部分分离程序该实验流程中沉Ⅰ：细胞核、质膜大片段、重线粒体，少量未破碎细胞及极少量沉Ⅱ→沉Ⅳ的成分。沉Ⅱ：重线粒体、质膜片段，及少量沉Ⅲ→沉Ⅳ成分。沉Ⅲ：线粒体、溶酶体，高尔基膜，部分粗内质网及极少量沉Ⅱ→沉Ⅳ成分。沉Ⅳ：所有的细胞质可溶部分。离心Ⅰ：低速冷冻离心机，50ml管。离Ⅱ，离Ⅲ为高速冷冻离心机8x50ml角转头。离Ⅳ为超速机或高速机8x50ml角转头或8x12ml角转头ⅱ）从沉Ⅱ中纯化线粒体：匀浆保持在200ml......阅读全文
亚细胞构造的离心分离典型实验
一）简介：用简易的差分离心结合各种型式的密度梯度离心可以分离和纯化各种亚细胞器。研究者也可以根据自己的设备情况对实验参数做一定的改动，也可以更多地利用速率-区带密度梯度离心或等密度离心来简化实验过程和提高分离纯度。二）实验：ⅰ）匀浆制备： 鼠肝12克加入0.25M蔗糖与5mM Tris-HCL(PH
亚细胞构造的离心分离概论
现代生物学研究常常需要提取和纯化细胞及组织中的亚细胞构造（细胞核、质膜、内笪纲、高尔基体、线粒体、溶酶体、微粒体等等）。在经过选择的最合适的生物体匀浆制备后，用离心法提取和纯化亚细胞构造是最常用、也是最有效的实验手段。 （一）匀浆制备： 将生物体组织剪切成2~3毫米小块或小片，以每100毫升加湿重
亚细胞（细胞器）构造的组成与功能
分离与纯化对象之一：“亚细胞（细胞器）”的构造与功能 上世纪20年代以Svedberg为首的欧洲科学家艰难研制的超速离心机原型主要目的是想分离和纯化病毒、细胞和亚细胞构造（细胞器），然而50年代中期开始生产的*代及以后的各代超速离心机，在很长一段时期内（50年代—80年代）主要用于分离和纯化
亚细胞（细胞器）构造的组成与功能（四）
三．内质网:(endoplasmic reticulum) 粗面内质网：最重要的功能是合成输出蛋白（或称分泌蛋白：包括各种肽类、激素、酶类和抗体） 滑面内质网：多方面功能，不同细胞中功能不同。 Ⅰ.脂质和固醇的合成； Ⅱ.蛋白质及脂类的
亚细胞（细胞器）构造的组成与功能（一）
上世纪20年代以Svedberg为首的欧洲科学家艰难研制的超速离心机原型主要目的是想分离和纯化病毒、细胞和亚细胞构造（细胞器），然而50年代中期开始生产的第一代及以后的各代超速离心机，在很长一段时期内（50年代—80年代）主要用于分离和纯化生物大分子、细胞、细胞器、病毒、血液组份等生物体。但从90年
亚细胞（细胞器）构造的组成与功能（二）
二种内质网可互相连接，一定条件下可转换，但构成成分及酶系差别很大。 △ 高尔基复合体：一般位于核附近 组成：扁平囊泡、大囊泡（又称分泌泡或浓缩泡）、小囊泡 △ 线粒体： 结构： 线粒体外膜。外室、基粒（可溶性ATP）、核糖体、内膜、脊。又分为板状脊与管状脊二种结构形式
亚细胞（细胞器）构造的组成与功能（三）
△ 微体： microbody (peroxisome) 在植物种子内称为乙醛酸循环体（glyoxysome）0.5um，单位膜内包有中等致密颗粒，常见于肝、肾上皮细胞、支气管无纤毛上皮细胞中。种类：● 有核样微体● 有边缘板或哑铃样微体 ● 无核样微样△ 中心粒： centrosome
血细胞的离心分离
在现代临床医学研究中，常常需要将全血中单核白细胞（淋巴细胞、大单核细胞）与红细胞和多形核白细胞分离。在临床治疗应用中常常需要将全血作成分分离（全血分离成血浆，血小板，白细胞，红细胞等等）（一）血细胞的实验室纯化：血液中存在着各种不同类型的血细胞，每种类型细胞有不同的特点和功能。医学研究常常需要较纯的
细胞和亚细胞提取物的制备实验
从组织和细胞中提取蛋白可能是蛋白质组研究中最关键的一步，因为这一步影响了蛋白的产率、生物活性和特定目的蛋白结构的完整性。因此，我们要注意蛋白提取条件的选择。主要目标是在破坏力最小、保持蛋白结构完整性的前提下，可重复地使细胞最大程度地裂解。方案1 哺乳动物组织的匀浆实验实验方法原理对于细胞内蛋白的纯化
细胞和亚细胞提取物的制备实验
方案1 哺乳动物组织的匀浆实验 方案2 用于免疫沉淀的培养细胞的裂解实验 方案3 用于免疫印迹的动物培养细胞、酵母和细菌的裂解实验 方案4 氮舱减压法裂解培养细胞实验 方案5 细菌中重组蛋白的小量提取实验 方案6 细菌中重组蛋白的
细胞和亚细胞提取物的制备实验
实验方法原理 对于细胞内蛋白的纯化和特性分析，重要的是选择一种有效的方法来破碎细胞或组织，使蛋白迅速地从胞内相对隔离的空间中释放到缓冲液中，而该缓冲液应对所研究的蛋白的生物活性没有影响。广泛使用的破碎软组织的方法之一是勻浆。在本方案中，讨论了使用机械力匀浆组织：在 Potter-Elvehjem
卵细胞的构造
在高等生物上，卵细胞是由 卵巢所产生的。所有哺乳类在出生时，卵巢内已经有未成熟的卵细胞存在，而且在出生后卵子数目不会增加。卵子和 精子结合受精便形成受精卵，即一个新生命的开始。一些动物（例如鸟类）是进行 体内受精的，而另一些动物（例如大部份的鱼类）则是进行体外受精。对人类的繁衍而言，必不可少的要
细胞和亚细胞提取物的制备实验3
方案3 用于免疫印迹的动物培养细胞、酵母和细菌的裂解实验实验方法原理去垢剂裂解细胞法通常用于培养的动物细胞。典型的离子型去垢剂SDS(如2%SDS)能充分地裂解细胞。培养的动物细胞和细菌，如可以使用这种方式裂解。假如实验所用的抗体识别的抗原决定簇取决于自然空间构象，并对还原环境敏感，那么在裂解缓冲液
细胞和亚细胞提取物的制备实验8
方案8 酵母提取物的制备实验实验方法原理由于酵母的经典遗传分析和分子遗传分析都已经研究得非常透彻，因而对于纯化重组动物蛋白来说，酵母是一个很有吸引力的表达体系。关于培养和收集酵母细胞的讨论，尤其是芽殖酵母，参见 Jazwinski(1990)。酵母细胞的裂解方法有很多种，包括自溶、压力破碎（如 Fr
细胞和亚细胞提取物的制备实验6
方案6 细菌中重组蛋白的大量提取实验实验方法原理利用细菌获得用于纯化的重组蛋白是非常方便的。适用于细菌细胞蛋白提取的方法包括超声波处理、玻璃珠研磨、钒土或石英砂研磨、French 加压罐高压剪切细胞和溶’菌酶处理。这些方法适用于从各种革兰阴性菌和革兰阳性菌中制备蛋白提取物。通常是使用酶的方法破坏细胞
细胞和亚细胞提取物的制备实验5
方案5 细菌中重组蛋白的小量提取实验实验方法原理利用细菌获得用于纯化的重组蛋白是非常方便的。为了检测诱导和重组蛋白的表达水平，评估方法的快速简单是很重要的。本方案使用 0.5% TritonX-1OO 裂解细胞，小量制备细菌提取物。实验材料表达目标重组蛋白的细菌细胞试剂、试剂盒二硫苏糖醇（DTT)样
细胞和亚细胞提取物的制备实验2
方案2 用于免疫沉淀的培养细胞的裂解实验实验方法原理培养的动物细胞一般使用温和去垢剂来裂解。如果低浓度的去垢剂就能引起细胞的充分裂解（如 l%NP-40 或 l%Triton X-100)，那么这对目标蛋白的影响可能比方案 1 中所讨论的匀浆方法更温和。去垢剂的选择必须根据免疫沉淀所用的抗体的识别表
细胞和亚细胞提取物的制备实验7
方案7 从包含体中溶解大肠杆菌重组蛋白实验实验方法原理由于分子克隆技术能够使细菌高水平表达蛋白，因此原核表达是一个非常便利的获得重组蛋白的系统。遗憾的是这些蛋白在细菌中易于聚合和沉淀，形成难溶解的包含体，因而很难纯化。非细菌蛋白的包含体尤其普遍。虽然没有一种可用于所有蛋白的普适方法，还是有许多策略适
细胞和亚细胞提取物的制备实验4
方案4 氮舱减压法裂解培养细胞实验实验方法原理通过来自增压舱中的氮气减压膨胀来破碎细胞是一种快速、有效的细胞和组织的匀浆方法，能释放完整的细胞器和制备细胞膜（Hunter and Commerford，1961)。该方法的原理很简单：细胞放在一个压力舱中，在高压下（约5500kPa，相当于800ps
细胞和亚细胞提取物的制备实验9
实验方法原理差异去垢剂分离法（differential detergent fractionation, DDF) 包括使用一系列含不同去垢剂的 PIPES 缓冲液对细胞进行连续抽提，首先是毛地黄皂苷，其次是 Triton, 最后是 Tween/脱氧胆酸盐。这些步骤产生 4 种在生化和电泳上相异的组
如何做蛋白亚细胞定位实验？
生物功能的区域化是生命的一种基本现象，这种区域化是通过不同层次的系统组成，从器官到特异细胞，再到细胞内部的亚细胞结构，最后到大分子复合物。在细胞水平，蛋白在特定的时间和空间发挥作用，这种区域化的定位为蛋白发挥作用提供特定的化学环境以及所需的互作因子等。蛋白的错误定位容易导致细胞活动的紊乱。因此，了解
细胞膜的构造
1.按组成元素分 构成细胞膜的成分有磷脂，糖蛋白，糖脂和蛋白质。 2.按组成结构分 磷脂双分子层是构成细胞膜的的基本支架。细胞膜的主要成分是蛋白质和脂质，含有少量糖类。其中部分脂质和糖类结合形成糖脂，部分蛋白质和糖类结合形成糖蛋白。 3.化学组成 细胞膜主要由脂质（主要为磷脂）、蛋白质
细胞膜的构造
1.按组成元素分 构成细胞膜的成分有磷脂，糖蛋白，糖脂和蛋白质。 2.按组成结构分 磷脂双分子层是构成细胞膜的的基本支架。细胞膜的主要成分是蛋白质和脂质，含有少量糖类。其中部分脂质和糖类结合形成糖脂，部分蛋白质和糖类结合形成糖蛋白。 3.化学组成 细胞膜主要由脂质（主要为磷脂）、蛋白质
细胞膜的构造
1.按组成元素分构成细胞膜的成分有磷脂，糖蛋白，糖脂和蛋白质。2.按组成结构分磷脂双分子层是构成细胞膜的基本支架。细胞膜的主要成分是蛋白质和脂质，含有少量糖类。其中部分脂质和糖类结合形成糖脂，部分蛋白质和糖类结合形成糖蛋白。3.化学组成细胞膜 [2]细胞膜主要由脂质（主要为磷脂）、蛋白质和糖类等物质
卵细胞的成分构造
卵细胞是球形的，有一个核，由卵黄膜包被着。 卵的外面具有外被(coat)，其成分主要是糖蛋白，是由卵细胞或其它细胞分泌的。在哺乳动物中这种外被叫做透明带(zonapellucida)，其作用是保护卵子，阻止异种精子进入。许多卵的透明带下面(皮质部，cortex)还有一层分泌性的囊泡，称为皮层颗
卵细胞的成分构造
卵细胞是球形的，有一个核，由卵黄膜包被着。 卵的外面具有外被(coat)，其成分主要是糖蛋白，是由卵细胞或其它细胞分泌的。在哺乳动物中这种外被叫做透明带(zonapellucida)，其作用是保护卵子，阻止异种精子进入。许多卵的透明带下面(皮质部，cortex)还有一层分泌性的囊泡，称为皮层颗
组织的分离实验_离心分离法
实验方法原理如培养物为血液、羊水、腹水和胸水等细胞悬液时，可采用离心法分离。一般用低速500~1000 转/分速度，离心5~10 分钟即可。如悬液量大，离心时间可适当延长，但如离心速度过大和时间太长，易压挤细胞使之受损或死亡。微量全血法淋巴细胞培养时，可不必进行淋巴细胞分离，可采用全血培养法。在需用
生物大分子的离心分离实验（二）
例（3）用CsCl 梯度分离DNA 并测定其组成（% G+C）（i）CsCl 溶液密度D 与溶液中CsCl 的重量百分比浓度P 之间的关系： D=138.11/（137.48-P）（ii） 制备初密度为1.706 克/毫升的梯度液，应按以下要求配置·4.85 克CsCl （分析纯）·50μl ，1.
生物大分子的离心分离实验（三）
例（6）用Cs2SO4 及尿素作梯度材料分离生物大分子样品：初步离心后的蛋白-核酸混合液梯度液：3.00g Cs2SO4 2.5ml 8M 尿素（经过混合床去离子处理的）50μl 1.0M Tris-HCl（PH7.4）25μl 0.2M EDTA（PH7.4）1.25ml 样品的水溶液以上各项充分
生物大分子的离心分离实验（一）
一、引言在八十年代以前，生物大分子（特别是核酸、蛋白）用离心方法分离纯化占有很重要的地位。用分析超离心方法测定生物大分子的分子量、沉降系数、扩散系数、微分比容等在生物化学实验中也占有一席之地。八十年代以后，由于离心技术的快速发展（微处理器的引入，变频驱动的完善、转速的提高等等），先进的制备用超速离心