一种新型纳流液相色谱柱制备技术

　　随着人们对生命科学的深入探索，高度复杂的生物样品对分离分析技术提出了更高的要求，nanoLC-MS（纳流液相色谱-质谱联用）是复杂生物样品分析的首选方法，但制备高分辨的纳流液相色谱柱仍然存在挑战。传统的高压匀浆制柱方法使用填料匀浆液直接进行高压填充，填充过程中填料易团聚沉降，导致柱床填充不均一，降低色谱柱的柱效和制柱效率（图1），尤其在长柱制备方面存在较大的技术障碍。虽然已有研究对传统匀浆填充的实验参数进行优化，但始终无法从根本上解决这一问题，因此亟需发展新的色谱柱制备技术。

　　图1. 传统匀浆法制柱中填料颗粒团聚现象

　　厦门大学化学化工学院的张博课题组前期针对毛细管填充柱的制备和应用开展了一系列研究工作：如长柱制备技术、单颗粒塞技术(Anal. Chim. Acta, 2014, 852, 267-273； J. Chromatogr. A, 2014, 1325, 109-114)，实现了高通量地制备高分辨率、高重现的毛细管色谱填充柱，同时也对不同类型毛细管填充柱的分离性能进行了深入探究(Anal. Chim. Acta, 2015, 863, 86-94； Anal. Chim. Acta, 2018, 1033, 205-212； Anal. Chim. Acta, 2019, 1062, 147-155； J. Chromatogr. A, 2021, 1648, 462218)。在以上研究基础上，为了消除匀浆填充中填料颗粒团聚沉降带来的不良影响，并解决长柱填充的困难，结合液滴微流控技术发展了一种新型纳流液相色谱柱制备技术（图2），将液滴作为动态、均一、相互独立的纳升级“匀浆罐”，从根本上解决了填料易团聚沉降的问题，克服了高浓度匀浆液使用时由于填料团聚沉降造成的柱床不均一与空腔问题，大幅提升制柱效率，同时获得均一紧实的柱床，有利于常规纳流液相色谱柱和高分辨纳流液相色谱长柱的制备，为复杂生物样品的高分辨分离需求提供了强有力的分析方法。

　　图2. 基于液滴微流控的纳流液相色谱柱制备示意图

　　研究过程中，对液滴微流控平台进行了优化，保证匀浆液滴的长时间稳定生成和收集，对填料颗粒在预组装液滴中的分布情况（图3）、柱床形成过程（图4）、柱床形貌进行了表征（图5），验证了这一技术的可行性，并使用此技术成功制备了3 m、5 m、10 m的超长纳流液相色谱柱（图6）。

　　图3. （A）20、100、180 mg/mL匀浆液液段：填料颗粒24 h呈分散状态；（B）20 mg/mL匀浆液直接注入毛细管：填料30 min时呈明显聚集状态。

　　图4. 柱床形成过程视频截图：填料匀浆液浓度为180 mg/mL，连续相（水相）流经柱床时柱床呈黑色，氯仿流经柱床时柱床呈透光状态。

　　图5. 激光共聚焦扫描显微镜表征柱床形貌3D图像：（A）180 mg/mL匀浆液、基于液滴微流控填充的色谱柱；（B）2 mg/mL匀浆液、传统高压匀浆法填充的色谱柱。

　　图6. 基于液滴微流控方法制备的3 m、5 m、10 m超长毛细管填充柱。边缘整齐的灰色部分为填充的柱床，不平整的黑色部分为毛细管外边缘。

　　研究表明，基于液滴微流控填充的色谱柱，在高浓度匀浆液180 mg/mL条件下具有更优的动力学性能和更优的复杂生物样品分析性能：以HeLa细胞蛋白酶解物为样品，10 cm短柱（填料粒径5 μm）显示出与商品化纳流柱（Waters，填料粒径1.7 μm）相当的分析性能，150 cm长柱和500 cm长柱的多肽分离性能显著提升，150 cm柱鉴定肽段数和蛋白质数分别提升了75.0%和38.4%，500 cm柱鉴定肽段数和蛋白质数分别提升了261.0%和82.3%。以上数据表明长柱具有更高的分辨率，能够显著降低质谱对多肽组分的漏检率，多肽的检出数量显著提升，多肽鉴定数和蛋白鉴定数大幅增加，数据的可信度也更高，对于蛋白质组学研究具有重要意义。

　　该工作相关论文近日发表在Analytical Chemistry 上，张博副教授为通讯作者，第一作者是王晓飞博士，朱珏、杨陈渝虎和秦飞为共同作者。