一种针对细胞表面受体进行抗体筛选的多重分析方法一

本文以人EGFR抗体与细胞表面EGFR抗原结合为例，描述TTP Labtech的mirrorball仪器作为一种“mix-and-read”方法在在抗体筛选中的应用。EGFR配体的蛋白家族参与了细胞迁移，粘附和分化等活动，包括乳腺癌，肺癌，结肠癌在内的许多疾病都和EGFR的过度表达有着密切的关系。

不同靶蛋白的单克隆抗体的应用领域不断扩大，可以用于不同疾病的治疗和诊断（譬如癌症，自身免疫性疾病）。单克隆抗体是特定细胞系针对特定抗原的分泌到细胞培养基中的生物蛋白，而高通量筛选是抗体开发的重要组成部分。

ELISA和Mix-and-read

利用传统ELISA技术在进行抗体筛选时有许多局限性，由于ELISA技术依赖于微孔板上包被的抗原，所以该方法不适合检测低溶解性的抗原（譬如细胞表面受体）。由于ELISA的操作方式，使得ELISA很难进行识别细胞表面抗原天然构象的抗体的筛选。即使对于可溶性抗原抗体筛选，由于微孔板对检测抗体的吸附从而改变蛋白构象，继而无法识别抗原特定抗原表位。

一种“mix-and-read”分析方法在生物制药行业的单克隆抗体筛选领域得到广泛应用。这种”mix-and-read”分析方法是将所有分析组分加到一个孔中，继而孵育从而使得结合达到平衡。对于抗体筛选，该方法可以利用包被抗原的珠子或者表达抗原的细胞进行分析，抗原抗体的相互作用可以通过结合在珠子或者细胞的荧光标记的偶联物的荧光强度进行检测。结合的荧光可以利用细胞技术仪无需洗涤进行分析，以达到区分测试孔中结合和游离的荧光。Lee等在发明FMAT时，详细介绍了相比传统ELISA方法细胞计数仪的优势。相对于传统的ELISA分析方法，利用该技术分析“mix-and-read”实验可以提高检测的灵敏度和分析的通量，同时也提高抗体的识别和检测。

高速的多重分析

TTP LabTech的mirrorball非常适合这种“mix-and-read”实验的分析，由于其灵敏度很高，从而可以检测低丰度表达的细胞膜蛋白。该仪器不仅能够快速进行单激光扫描，而且可以同时进行405,488,640nm激光扫描，因此可以进行多种荧光素的选择。其可以不依赖于激发光直接对发射荧光进行矫正的能力，从而在抗体筛选应用中可以对珠子和细胞进行多重分析。

该文章中以人EGFR抗体与细胞表面EGFR抗原结合为例，描述TTP Labtech的mirrorball仪器作为一种“mix-and-read”方法在在抗体筛选中的应用。EGFR配体的蛋白家族参与了细胞迁移，粘附和分化等活动，包括乳腺癌，肺癌，结肠癌在内的许多疾病都和EGFR的过度表达有着密切的关系，因此抑制EGFR的表达和激活在治疗这些疾病过程中起着非常重要的作用。

为了检测mirrorball的检测敏感性，该通讯利用两种高表达EGFR的上皮癌细胞系A549和A431进行检测不同浓度的抗EGFR受体与EGFR的结合能力的分析。传统筛选方法是采用表达和不表达抗原的细胞分别进行抗体的结合能力以达到筛选抗原特异性的抗体，譬如利用转染目的基因的细胞和未进行转染的宿主细胞进行反筛选。如果利用已有的筛选平台（例如： ELISA和FMAT），需要进行制备两种板以比较抗体对这两种细胞的结合能力，从而确定抗原特异性的结合能力。

在该实验中，mirrorball可以在一个细胞微孔板中对多种细胞进行抗体结合能力的测定，以区分抗体对不同细胞的特异性结合。mirrorball的这种多元化分析能力在大大降低实验的成本的同时，可以提高筛选的通量，排除微孔板之间的差异。