三氯乙酸沉淀实验

2. 作为蛋白质变性剂使蛋白质构象发生改变，暴露出较多的疏水性基团， 使之聚集沉淀。

3. 随着蛋白质分子量的增大，其结构复杂性与致密性越大，TCA 可能渗入分子内部而使之较难被完全除去，在电泳前样品加热处理时可能使蛋白质结构发生酸水解而形成碎片，而且随时间的延长这一作用愈加明显。

蛋白样品

丙酮 分子量标准 TCA+DOC 加与不加2-巯基乙醇的样品缓冲液

聚丙烯微量离心管

材料与设备

丙酮（Aldrich Chemical Co.Inc.)
注：保存于室温。不能放入冰箱。

聚丙烯微量离心管 (1.5-ml)
注：1. 用前将离心管洗干净。2. 分析极少量蛋白质（<100ng)时，也许必需按下述方法将离心管硅烷化：将离心管短时（5 min)浸泡于5%(v/v)二氯二甲基硅烷（Aldrich Chemkai Co.Inc.）氯乙烯溶液中，然后用乙醇（100%)和玻璃蒸馏水洗涤。离心管在室温下至少干燥1天, 硅烷化后，有些蛋白质与聚丙烯结合较紧。不幸的是这一性质相对而言是经验性的，不能预先知道待测蛋白质是否会留存于洗净的聚丙烯或硅烷化的离心管壁上。

分子量标准（任选)

试剂与缓冲液

TCA+DOC

加与不加2-巯基乙醇的样品缓冲液（1X)

(配方，见"试剂与缓冲液的配制，P.262)

操作程序

1)加1/4体积的 TCA+DOC于蛋白质组分（置1.5-ml聚丙烯微量离心管中），至TCA的终浓度为20%(w/v)。震荡混合。

2)冰上解育20~30 min。

3)微型离心机，室温离心15 min。沉淀物如可见，为粘稠的带黄褐色的胶状物。用一精细的巴氏吸管吸出上清。努力除去尽可能多的上清。如取100ul样品进行沉淀，沉淀物将是可见的。

4)加3倍体积（原样品体积的丙酮（室温)。样品在室温下静置约10 min, 使TCA+DOC溶于丙酮。

5)室温离心15 min。其时，沉淀物的大小和物理特性类似于一点灰尘。约10ug或更多一点的蛋白质即可看见。有时，会得到白色的盐类（如KCl等）沉淀物。用极精细的巴氏吸管移去上清。沉淀物置冰上干燥10 min(敞开1.5-ml离心管的盖)。干燥的沉淀物可长时间（>1 个月）地保存于-20℃。

6) 用含 2-巯基乙醇的样品缓冲液（lx)(对于标准的小型平板凝胶装置，用 6ul) 溶解沉淀物。如仍有少量的TCA 残留物，溴酚蓝将转呈黄色。这无关紧要，因为电泳时有足够的缓冲能力来中和痕量 TCA。如沉淀物中有残留的 KCl, 将样品缓冲液加于沉淀的蛋白质时，将会形成絮状的白色沉淀（十二烷基硫酸钾）。如十二烷基硫酸钾发生沉淀，就很难将样品加于 SDS 凝胶，但样品一旦加到凝胶上，电泳将会很好地进行。

7) 若需分子量标准参照物，则可用不含 2-巯基乙醇的 lxSDS 样品缓冲液将蛋白质分子量（MW) 标准配制成每毫升含 0.5 mg 总蛋白的储液。分成小等分试样 (50ul) 储存于-20℃。对于银染，可取 2ul 分子量标准+4ul 含 2-巯基乙醇的样品缓冲液，至终体积为6ul。

1. 蛋白沉淀实验中，要充分震荡使得三氯乙酸能够与溶液中的蛋白质充分结合

2. 室温下孵育10min

三氯乙酸是最有效的蛋白沉淀剂，但试剂中常常含有杂质，致使影响方法中的空白值偏高，其次是出去蛋白质后若采用乙醚为提取溶剂，则三氯乙酸会溶于乙醚中干扰测定。

本实验介绍关于三氯乙酸沉淀法的过程。本实验来源于蛋白质纯化与鉴定实验指南，作者：朱厚础。