三篇Nature子刊：如何克服CRISPR的脱靶效应

　　规律成簇的间隔短回文重复CRISPR与内切酶Cas9的组合，原本是细菌抵御病毒的重要武器，现在这一组合已经成为了一个通用工具，被用于在真核生物中进行位点特异性的基因组修饰。

　　最近Nature Biotechnology杂志上发表了三个研究团队的研究成果，研究人员深入分析了CRISPR的脱靶效应，并提出了非常可行的解决之道。

　　CRISPR系统修改目的基因的简便性，让几乎所有实验室都有可能随心所欲的进行基因组编辑。你需要做的只是，在自己感兴趣的细胞或生物中，表达Cas9内切酶和引导RNA（gRNA）。引导RNA是一段与目标DNA片段匹配的短RNA，它指导着CRISPR-Cas9的DNA剪切活性。

　　不过困扰其他定向核酸酶的老问题——脱靶效应，也同样影响着CRISPR系统。人们发现，Cas9会在基因组的一些脱靶位点进行剪切。弗吉尼亚大学Mazhar Adli等人的研究显示，在人类基因组中Cas9除了结合目的基因以外，还殃及了许多其他的位点。

　　Adli及其同事构建了失去酶活性的Cas9（dCas9），并将其与12种不同的gRNA搭配。随后他们通过ChIP-seq技术，在HEK293T细胞中检验了dCas9在全基因组的结合情况。研究人员发现，脱靶结合的多少主要取决于gRNA。对于绝大多数gRNA而言，dCas9能结合几十到几百个脱靶位点（Kuscu et al., 2014）。研究显示，具有酶促活性的Cas9的确会切割这些ChIP-seq鉴定的脱靶位点（尽管不是全部）。

　　这项研究告诉我们，CRISPR系统的特异性可能无法满足某些应用的需求。应该怎么办呢？Adli等人认为，可以用Cas9 nickase代替野生型Cas9进行基因组编辑。Cas9 nickase是一种突变型Cas9，只切割一条DNA链。

　　然而，哈佛大学David Liu研究组和麻省总医院Keith Joung研究组找到了更好的办法（Guilinger et al., 2014 and Tsai et al., 2014）。他们的策略是对Cas9进行基因工程改造，让其依赖二聚化才能酶切，就像锌指核酸酶（ZFN）和TALEN那样。二聚化酶有着更严格的序列要求，理论上应该能够大大减少脱靶位点的数量。

　　这两个研究团队不约而同地将Fok1核酸酶融合到了dCas9的N端，与ZFN和TALEN中的方向相反。他们发现，融合而成的二聚酶与Cas9的正确切割效率相差不多。Liu和Joung两个团队还通过深度测序，检验了野生型Cas9的那些脱靶位点，发现二聚酶显著减少了可检测到的脱靶事件。